嗜酸细胞性食管炎和胃食管反流病患儿聚丝蛋白和骨膜蛋白表达水平分析

冯 娜， 刘 庆， 谢坤霞, 赵 斌

延安大学附属医院 1.儿科; 2.病理科，陕西 延安 716000

嗜酸性粒细胞性食管炎(eosinophilic esophagitis，EOE)是一种慢性复发性炎性疾病，目前认为该疾病是环境和遗传因素之间复杂相互作用的结果[1]。部分研究认为上皮屏障结构和/或功能缺陷可能是EOE相关炎症发展和持续的关键因素[2]。目前对EOE的一线治疗主要包括药物(皮质类固醇)、饮食、扩张治疗，对于婴幼儿患者临床常采用前两种治疗方式。

聚丝蛋白(filaggrin，FLG)是皮肤角质层的主要蛋白质成分，对保持表皮完整性具有重要意义[3]。FLG基因功能丧失型突变与影响黏膜表面的特应性疾病有关，然而仅有限数据表明FLG可能在EOE中的表达下调[4]。骨膜蛋白(periostin，POSTN)是一种基质细胞蛋白，与细胞外基质成分结合，调节参与细胞黏附和运动信号通路[5]。有研究[6]表明，POSTN可能在EOE中过度表达并促进过敏原诱导的组织嗜酸性粒细胞(EOS)增多。

因此本研究旨在通过胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)患儿和正常对照组儿童的比较，评估EOE患儿食管组织样本中FLG和POSTN的免疫组织化学表达水平。并研究FLG/POSTN免疫染色模式与EOE患儿临床病理特征包括：症状严重程度、每高倍视野EOS的最大值之间的潜在相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2015年3月至2017年3月在我院消化科接受治疗的患儿为研究对象。纳入标准：(1)年龄1～12岁；(2)符合EOE、GERD诊断标准的患儿。对照组为正常儿童，但选择年龄、性别匹配，既往曾在医院接受食管胃十二指肠镜(esophagogastroduodenoscopy diagnosis，EGD)检查，诊断为功能性疾病并保留活检样本的儿童；(3)本人或监护人签署知情同意书。排除标准：(1)质子泵抑制剂(proton pump inhibitor，PPI)禁忌证患儿；(2)诊断为除EOE、GERD外其他消化科疾病患儿；(3)未签署知情同意书者。本研究方案获得医院伦理委员会批准。在EOE婴幼儿(1～3岁)中，烦躁、进食困难、呕吐和腹痛的症状视为轻度症状，而窒息和噎塞史、重度拒食导致体质量下降、或出血则视为中/重度症状。在EOE大龄儿童(>3岁)中，呕吐和胃灼热伴有胸骨后疼痛的症状视为轻度症状，而吞咽困难和食物嵌塞视为中/重度症状。

1.2 研究设计所有患儿入组前均接受8周PPI预治疗，入组时进行内镜检查和食管(近端、中端和远端)(首次活检)。此外，在EOE最终诊断后开展体外特异性IgE检测测定IgE介导的食物过敏原，开展特应性斑贴试验测定非IgE介导的食物过敏原。满足EOE临床和组织学诊断标准患儿根据症状严重程度和过敏测试结果给予过敏原剔除饮食和/或皮质类固醇(口服泼尼松)治疗8周，之后再次开展EGD和活检(“二次活检”)。此外在首次和二次活检时，对EOE亚组进行FLG和POSTN免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)检测。GERD亚组仅首次活检时开展IHC检测。对照组根据存档活检样本开展IHC检测。所有最终诊断为GERD患儿则继续PPI治疗。

1.3 IHC测定采用标准程序[7]活检切片进行IHC染色。由2名独立病理科医师对设盲染色结果进行评估。使用半定量3级分级系统对FLG和POSTN免疫染色进行评分。FLG免疫染色程度评分如下：无细胞染色计0分；<10%的细胞染色计1分；10%～50%的细胞染色计2分；>50%的细胞染色计3分，染色强度分级：0=阴性，1=弱阳性，2=中阳性，3=强阳性。FLG免疫反应总评分≥3分为阳性，总评分≤2分为阴性。POSTN免疫染色评分为阴性(染色细胞<5%)；中度染色(斑片状/局灶性表达，5%～50%细胞染色)；强染色(弥漫性表达，染色细胞>50%)。中/强染色均视为阳性。

2 结果

2.1 基线人口特征及首次活检结果EOE、GERD和对照组性别和年龄分布差异无统计学意义(分别为P=0.57和0.62)，具有可比性。与EOE组相比，GERD组首次(预治疗)活检时平均EOS数量为(6.7±6.5)个，对照组所有正常受试者EOS均为0个(P<0.001)。在EOE患儿中，6/16例(37.5%)评估为轻度症状，10/16例(62.5%)评估为中/重度症状(见表1)。

研究采集所有受试者预治疗以及治疗后的活检样本，上述16例EOE患儿中，14例(14/16，87.5%)接受食物剔除治疗，6例患儿(6/16，37.5%，均为中/重度症状)接受皮质类固醇治疗，其中4例(4/16，25.0%)患者同时接受两种治疗方式。治疗后所有接受治疗的患儿临床症状均得到改善。

表1 基线人口特征及首次活检结果Tab 1 Baseline demographic characteristics and the first biopsy results

注：*:重度EOE 6例。

2.2 免疫组化结果预治疗后，所有正常受试者(16/16，100%)及大多数GERD病例(10/16例，62.5%)的组织切片FLG染色阳性，然而所有EOE患儿(16/16，100%)食管组织切片(首次活检)均呈阴性(见表1、图1)。相反，所有EOE患儿(16/16，100%)及几乎所有GERD病例(14/16，87.5%)的食管黏膜组织(上皮，偶见于黏膜固有层)POSTN染色呈弥散性强阳性，主要见于细胞质和细胞外基质，细胞核染色较少见，但正常儿童食管组织未见染色(见表1、图2)。在首次活检时，FLG染色阳性的GERD患儿EOS均数较低(6.7±6.5)，然而未见免疫染色结果与性别或年龄之间有相关性。

注：200倍；比例尺=100 μm。

在出现临床改善和组织学改善后，治疗后活检时EOE组FLG染色恢复及POSTN表达水平降低的患儿百分比显著提高(FLG为75.0%，POSTN为37.5%，P均<0.001)(见表2、图1和图2)。对比两次活检结果，发现总体EOE患儿样本，轻度和中/重度症状患儿亚组FLG染色阴性的病例比例显著降低，差异有统计学意义(P均<0.001)。

对比两次活检结果，总体EOE患儿，轻度症状亚组患儿POSTN染色阳性病例比例显著下降，差异有统计学意义(P均<0.001)。此外研究还发现总体患儿样本及所有患儿亚组平均EOS值均显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。重复测量ANOVA的交互作用结果显示，根据症状严重程度检测的EOS降低程度相似(P>0.05)。

注：200倍；比例尺=100 μm。

Fig 2 POSTN staining resultsA: POSTN staining of esophageal biopsy in children with EOE showed strong positive staining of epithelial and lamina, and staining of epithelial cells in pretreatment; B: POSTN staining of esophageal biopsy in children with EOE showed negative/weak positive staining of epithelial and lamina propria in post-treatment; C: epithelial cells were positive for POSTN staining in GERD children;

D: epithelial cells were negative for POSTN staining in normal subjects

3 讨论

本研究证实，与对照组正常食管组织相比，EOE患儿食管黏膜中FLG和POSTN的免疫组化表达水平同时分别下调和上调。在药物和饮食治疗干预出现良好临床反应之后，研究发现，相当比例的患儿群体上述变化出现逆转，差异具有显著统计学意义。FLG免疫染色正常化的比例尤其显著，在接受治疗的患儿中占75.0%。

先前的基因表达研究表明，EOE的特征在于各种炎症介质和上皮分化复合基因(包括FLG)的表达失调，从而可能导致食管黏膜上皮屏障功能受损，进而对感染性和过敏性颗粒的渗透性增加[8-10]。BLANCHARD等[11]研究发现，活动性EOE患者的FLG mRNA水平相比对照组降低；此外，FLG基因表达水平在治疗成功患者和对照患者之间差异无统计学意义，表明EOE中的FLG表达水平的变化可以通过适当的治疗恢复至或至少接近正常水平。

此外，KATZKA等[12]研究显示，活动性EOE可能与细胞间隙扩张和伴随FLG表达水平的降低有关，且类固醇治疗可降低细胞间隙扩张并恢复FLG染色。尽管尚未证明这些发现是否为EOE独有，但可以设想，FLG染色丧失可能与EOE病理生理学有关。而这种蛋白质的染色密度可能会由于活动性疾病患者接受的类固醇治疗而发生改变。

表2 EOE患儿总体样本及根据症状严重程度列示的首次和二次活检FLG和POSTN免疫染色结果Tab 2 Overall sample of EOE children and results of FLG and POSTN immunostaining by the first and second biopsies based on severity of symptoms

与FLG在EOE中显著下调相反，POSTN似乎在未经治疗的EOE患者食管黏膜中过度表达。但目前为止，关于该问题的数据非常有限，先前对活动性EOE患者食管活检样本基因表达谱分析显示，与正常受试者相比，炎症黏膜中POSTN水平显著升高，并在类固醇治疗疾病缓解后大部分恢复正常[13]。

虽然之前已经证实POSTN几乎仅在成纤维细胞或各种癌组织中表达，但实验数据显示用白细胞介素-13处理上皮细胞也可能诱导POSTN在此类细胞中表达[14]。此外，POSTN可增强上皮-间质转化，并且与上皮细胞标记物的丢失和过敏性炎症过程中上皮细胞与成纤维细胞之间的稳态相互作用的破坏有关[15]。

在本研究中，绝大多数(14/16，87.5%)GERD患儿POSTN过表达，而FLG的表达更加多变，62.5%的病例显示FLG免疫染色正常(阳性)。这些研究表明，与EOE类似，GERD也可能主要表现为POSTN表达失调。此外，还有待进一步探讨该标志物的过表达是否能够反映GERD患者易感EOE的特征。

然而，本研究的局限性为研究患者数量相对较少，小样本量是罕见疾病(如EOE)研究所固有的局限性，因此尚需要开展更大型的分层研究分析。

综上，本研究表明，EOE患儿食管黏膜FLG和POSTN的表达可发生改变，治疗后大部分患儿这种改变是可逆的。但仍有必要开展大型研究对这些发现及其确切的诊断意义作进一步研究。