李 敏,叶 慧,陈骁鹏,姜 玮,吴 芸
(江苏省泰州市食品药品检验所,江苏 泰州 225300)
图1 高效液相色谱图
血塞通片主要成分为三七药材中的三七总皂苷,有活血祛瘀、通脉活络功效,其现行标准[1]含量测定项以紫外-可见分光光度法测定三七总皂苷的含量[2]。本研究中建立了高效液相色谱(HPLC)法同时测定血塞通片中5种皂苷类成分的含量。现报道如下。
WatersAcquityArc高效液相色谱仪,包括Empower3工作站、四元梯度泵、2998型二极管阵列检测器、自动进样器和柱温箱(美国Waters公司);8200型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司);Milli-Q型超纯水处理系统(美国Millipore公司);XS105DU型电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)。
三七皂苷R1对照品(批号为110745-201318,含量94.0%),人参皂苷 Rg1对照品(批号为 110703-201530,含量 91.7%),人参皂苷 Re对照品(批号为110754-201626,含量 97.4%),人参皂苷 Rb1对照品(批号为110704-201424,含量93.7%),人参皂苷 Rd对照品(批号为111818,含量92.1%),均购自中国食品药品检定研究院;血塞通片(云南安特呐制药股份有限公司,批号分别为 170516、160412、170937;湖南湘雅制药有限公司,批号为1704101;昆药集团血塞通药业股份有限公司,批号为161227;湖南绅泰春药业有限公司,批号为 20150701、20160301);乙腈为色谱纯,甲醇为分析纯,水为超纯水。
色谱柱:XBridge C18柱(250 mm ×4.6 mm,3.5 μm);流动相:乙腈溶液(A)-水(B),梯度洗脱(0~20 min 时20%A,20~45 min时 20%A→46%A,45~55 min时46%A→55%A,55~60 min时 55%A,60~62 min时55%A→20%A,62~70min时 20%A);流速:1.0mL/min;柱温:30 ℃;检测波长:203 nm;进样量:10 μL。各相邻成分之间分离度较好(R>1.5),理论板数按人参皂苷Rg1峰计应不低于5 000。
称取各对照品适量,精密称定,加甲醇制成含三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Re、人参皂苷 Rb1、人参皂苷Rd的混合对照品溶液。取样品10片,除去包衣,称定质量,研细,混匀,取约40 mg,精密称定,置10 mL容量瓶中,溶解并定容,摇匀,滤过,取续滤液,即得供试品溶液。按样品处方取缺三七总皂苷的适量赋形剂制成阴性样品,按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。
专属性试验:取2.2项下混合对照品溶液及阴性对照溶液,按2.1项下色谱条件进样分析,记录色谱图。结果,在各待测成分峰处阴性对照无干扰,详见图1。
线性关系考察:取混合对照品溶液适量,加甲醇稀释成不同质量浓度,按2.1项下色谱条件分别进样10 μL,记录峰面积,以峰面积(Y)为纵坐标、进样量(X,mg)为横坐标进行线性回归。结果见表1。
表1 5个成分线性关系考察结果(n=3)
定量限与检测限考察:精密吸取混合对照品溶液适量,加甲醇逐级稀释,进样测定,以信噪比(S/N)≥10测定各成分定量限,以S/N≥3测定各成分检测限。结果见表1。
精密度试验:取2.2项下混合对照品溶液,按2.1项下色谱条件,连续进样6次,记录峰面积。结果三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd色谱峰面积的RSD分别为 0.34% ,0.25%,0.23% ,0.26%,0.24% (n=6),表明仪器精密度良好。
稳定性试验:吸取同一供试品溶液(批号为170516),室温下分别放置 0,2,4,8,12,16,20,24h 时按 2.1 项下色谱条件进样,记录峰面积。结果三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 的色谱峰面积的RSD分别为 0.83% ,0.56%,1.23%,0.78%,1.04%(n=8),表明供试品溶液室温下放置24h内稳定。
重复性试验:取同一批样品(批号为170516)6份,依法制备供试品溶液,按2.1项下色谱条件进样测定,记录峰面积并计算含量。结果三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 的平均含量分别为每片 9.74,33.75,4.51,34.18,8.75 mg,RSD分别为 1.00% ,0.87% ,1.82% ,0.82%,0.77%(n=6),表明方法重复性良好。
加样回收试验:取已知含量的样品(批号为170516),研细,称取6份,每份约20 mg,精密称定,再精密加入一定质量浓度的混合对照品溶液,按2.1项下色谱条件进样测定,记录峰面积,计算回收率。结果见表2。
表2 加样回收试验结果(n=6)
取7批样品,依法制备供试品溶液,按2.1项下色谱条件进样测定,以外标法计算样品中5种成分的含量。结果见表3。
表3 样品含量测定结果(n=3)
采用甲醇作为提取溶剂,分别超声30 min和直接溶解,进样,比较峰面积,结果直接溶解的提取率更高,可能是由于超声过程中皂苷类分解加速,故选用直接溶解[3-4]。分别称取 10,20,30,40,50 mg 样品,直接溶解,进样,比较峰面积,结果40 mg的提取效率最高。
2015年版《中国药典(二部)》西洋参药材检测中以乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脱,结果人参皂苷Rd出峰太快,分离度差,且分离时间过长。查阅有关文献[5-7],发现大多选用乙腈-水为流动相,同时血塞通片以三七总皂苷为原料药,样品色谱图中杂质峰相对较少,考虑到人参皂苷Rg1和人参皂苷Re分离度不佳,以及人参皂苷Rd极性小、出峰时间晚的问题,通过对梯度洗脱程序的调整,最终选用70 min的梯度洗脱系统。
综上所述,本HPLC法简便可行,准确可靠,重复性好,结果稳定,可用于血塞通片中5种皂苷类成分的同时测定。