微生态制剂对海水养殖系统硝化功能建立过程的影响

刘意康， 刘 洋， 徐爱玲， 宋志文

(青岛理工大学 环境与市政工程学院，山东 青岛 266033)

近年来，我国对虾养殖业产量和规模迅速扩大并多年居于世界首位。长期以来，池塘养殖是我国对虾的主要养殖模式，据统计，养殖1 kg对虾要消耗20 t清洁水源，并且大多不经处理直接排放，对环境造成了污染。在养殖过程中，对虾排泄、残饵分解等产生氨氮和亚硝酸盐，如果不能及时去除，会造成氨或亚硝酸盐积累。氨和亚硝酸盐是诱发暴发性虾病的重要原因，氨过高会使对虾血氨升高，血液结合氧能力下降，产生毒血症；亚硝酸盐会使血液中血蓝蛋白载氧能力下降，严重时导致对虾中毒死亡。可见，对虾养殖过程中，水质净化是需首要解决的问题，而问题的关键是氨和亚硝酸盐的去除[1-3]。现有池塘养殖、循环水养殖系统(RAS)和生物絮团技术(BFT)等方式，分别存在换水量大、病害频发，投资、运营及技术要求高，操作和管理过程复杂等问题[4-5]。有益微生物作为一种生态调控剂，能够调节微生态平衡，在水产养殖中的应用越来越广泛[6]。硝化菌、枯草芽胞菌和光合细菌是对虾养殖中常用的微生态制剂，其中硝化菌包括氨氧化细菌(AOB)、氨氧化古菌(AOA)和亚硝酸盐氧化菌(NOB)等，能够将氨和亚硝酸盐转化为毒性较低的硝酸盐[7]。枯草芽胞杆菌能够有效降解残饵和排泄物，抑制致病菌生长，并可利用同化作用去除部分氨和亚硝酸盐[8]。光合细菌以小分子碳水化合物为碳源，利用铵、亚硝酸盐、硝酸盐等合成有机氮，起到净化水质的作用[9]。本研究通过投加不同微生态制剂、碳源以及生物膜载体，比较分析不同运行条件下海水养殖系统硝化功能的建立过程，为实际应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 海水养殖系统 系统由塑料桶(直径0.45 m，高0.8 m，有效容积150 L)、加热棒、曝气盘等组成。曝气盘由PVC软管与空气压缩机连接，置于系统底部，生物毛球包悬挂于水体中，实验前用高锰酸钾对系统进行消毒。人工海水由海水素配制，盐度为18‰。

1.1.2 微生态制剂 光合细菌和硝化细菌制剂由本实验室自行制备，其中硝化细菌为氨氧化菌和亚硝酸盐氧化细菌混合培养物，活菌数量为3.67×107cfu/mL，其中氨氧化菌比例为60%～65%，亚硝酸盐氧化菌为35%～40%；光合细菌活菌数量为4.32×106cfu/mL；枯草芽胞杆菌购自青岛某公司，本实验室测定活菌数量为6.12×106cfu/mL。

1.1.3 载体 纤维毛球直径(30±2) mm，孔隙率96%，比表面积3 000 m2/m3，实验前纤维毛球用蒸馏水清洗，1×105Pa灭菌30 min，然后将纤维毛球填充在35 cm×40 cm筛绢(100目)网兜中。

1.1.4 试剂 无菌蒸馏水、碳酸氢钠(AR)、溴酸钾(AR)、溴化钾(AR)、对氨基苯磺酰胺(AR)、氢氧化钠(AR)、磺胺(AR)、N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐(AR)、盐酸(GR)、氨基磺酸(AR)。

1.1.5 仪器与设备 UVmini-1240光度计(岛津国际贸易有限公司)、FA2004N电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)、HQ30d溶解氧仪(哈希水质分析仪器有限公司)、Brix/ATC FG-113盐度计(山海双旭电子有限公司)、HQ11d pH计(哈希水质分析仪器有限公司)、MLS-3750高压蒸汽灭菌器(SANYO)。

1.2 方法

1.2.1 实验方案 控制系统温度(28±0.5) ℃，pH值为 (8.0±0.5)，7.5 mg/L≤DO≤8.5 mg/L。系统微生态制剂、碳源投加和载体设置情况如表1。硝化细菌每天投加一次，采取毛球包内和水体内交替投加的方式，枯草芽胞杆菌、光合细菌和糖蜜直接投加到水体中。添加氯化铵，使氨氮初始质量浓度为2 mg/L，待氨氮与亚硝酸盐氮降低至检测不出时，再分别将氨氮初始质量浓度提升至4 mg/L和6 mg/L。试验期间不换水且每5 d补充蒸发水量至150 L。每12 h测定水体中氨氮、亚硝氮、pH、溶解氧。

表1 海水养殖系统编号，微生态制剂、碳源投加和人工基质设置情况Table 1 The Number, microecological preparation, carbon source and artificial substrate setting of mariculture system

注：“-”表示不添加相关菌剂和载体

1.2.2 分析方法 氨氮采用次溴酸钠氧化法测定[10]；亚硝酸盐氮采用重氮偶联法测定[11]；硝酸盐氮采用紫外分光光度法测定[11]；pH采用HQ11dpH计测定；DO采用HQ30d溶解氧仪测定；盐度采用Brix/ATC FG-113盐度计测定；数据处理采用Origin 9.0软件。

2 结果与分析

2.1 不同微生态制剂对养殖系统硝化功能建立过程的影响

1 #和4 #系统均设置纤维毛球作为生物膜载体，其中1 #投加硝化细菌+枯草芽胞杆菌，4 #投加硝化细菌+光合细菌，试验过程中氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮浓度变化情况见图1。从图1可以看出，在试验过程中两个系统氨氮均呈明显下降趋势，亚硝酸盐氮呈先升高再降低趋势，硝态氮浓度呈上升趋势。在氨氮质量浓度由2 mg/L升高到6 mg/L过程中，两个系统氨氮和亚硝酸盐氮变化情况存在差异，随着氨氮浓度升高，两个系统氨氧化强度均明显提高，分别由0.68 mg/(L·d)、0.62 mg/(L·d)提升至1.36 mg/(L·d)、1.69 mg/(L·d)；亚硝酸盐浓度峰值均呈升高趋势，但差别不大，并且峰值浓度明显低于氨氮初始浓度；硝酸盐氮浓度在亚硝酸盐氮浓度达到峰值后迅速增加，但其浓度低于氨氮初始浓度。

图1 设置纤维毛球和投加不同微生态制剂的养殖系统氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮浓度变化情况Fig.1 The changes in the concentration of in the mariculture system with adding fiber ball and different microecological preparations

2.2 添加纤维毛球包对养殖系统硝化功能建立过程的影响

1 #系统设置纤维毛球，2 #系统未设置纤维毛球，二者均投加硝化细菌+枯草芽胞杆菌，其氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮浓度变化情况见图2。从图2可以看出，试验过程中两个系统氨氮均呈明显下降趋势，亚硝酸盐氮呈先升高再降低趋势，硝态氮浓度均呈上升趋势。在氨氮质量浓度由2 mg/L提高到6 mg/L过程中，两个系统氨氮和亚硝酸盐氮变化情况存在差异，随着氨氮浓度提高，氨氧化强度均有明显提升，分别由0.68、0.47 mg/(L·d)提升至1.36、0.98 mg/(L·d)；亚硝酸盐浓度峰值均呈升高趋势，并且峰值浓度明显低于氨氮初始浓度，在氨氮浓度2 mg/L时，系统亚硝酸盐氮浓度分别在72、84 h达到峰值(峰值浓度为0.33、0.39 mg/L)，并分别于96、120 h后完成系统硝化功能的建立，添加毛球包的生物膜系统硝化功能建立时间更短；硝酸盐氮浓度在亚硝酸盐氮浓度达到峰值后迅速增长，且硝酸盐氮浓度低于氨氮初始浓度。

图2 设置与不设置纤维毛球但投加相同微生态制剂的养殖系统氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮浓度变化情况Fig.2 The changes in the concentration of in the mariculture system with adding fiber ball and not adding fiber bal

2.3 添加碳源对养殖系统硝化功能建立过程的影响

1 #和3 #系统均设置纤维毛球作为生物膜载体，并投加硝化细菌+枯草芽胞杆菌，但3 #系统试验过程中投加糖蜜作为有机碳源，其试验过程中氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮浓度变化情况见图3。从图3可以看出，试验过程中两个系统氨氮均呈明显下降趋势，亚硝酸盐氮呈先升高再降低趋势，硝态氮浓度呈上升趋势。在氨氮质量浓度由2 mg/L提高到6 mg/L过程中，两个系统氨氮和亚硝酸盐氮变化情况存在差异，随着氨氮浓度提高，氨氧化强度均有明显提升，分别由0.68、0.85 mg/(L·d)提升至1.36、1.18 mg/(L·d)；亚硝酸盐浓度峰值均呈升高趋势，但差别不大，峰值浓度明显低于氨氮初始浓度，在氨氮质量浓度为2 mg/L时，亚硝酸盐氮浓度分别在72、60 h达到峰值(峰值浓度为0.33 、0.31 mg/L)并分别在96、84 h后完成硝化系统建立，添加碳源会加快系统硝化功能的建立；硝酸盐氮浓度在亚硝酸盐氮浓度达到峰值后迅速增长，且硝酸盐氮浓度低于氨氮初始浓度。

图3 投加与不投加碳源养殖系统氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮浓度变化情况Fig.3 The changes in the concentration of in the mariculture system with adding fiber ball or not adding carbon source

3 讨 论

水产养殖系统中由于生物排泄及残饵、粪便分解，会造成有毒物质增加，其中氨和亚硝酸盐是主要去除目标，有效控制系统中氮的存在形式和浓度、减少氨和亚硝酸盐危害主要通过建立养殖系统硝化功能来实现。在该过程中，主要涉及三种微生物类群，即异养菌、氨氧化菌(包括Ammonium-oxidizing bacteria，AOB；Ammonia oxidizing archaea，AOA)和亚硝酸盐氧化细菌(Nitrite-oxidizing bacteria，NOB)，异养菌将残饵分解为氨氮，氨氮在氨氧化菌作用下转化为亚硝酸盐氮，后者进一步被亚硝酸盐氧化菌转化为硝酸盐氮。由于异养菌、氨氧化菌和亚硝酸盐氧化细菌间代时差别较大，产生的氨和亚硝酸盐不能及时转化，会出现氨和亚硝酸的积累并产生浓度峰值[12]。一旦水产养殖系统硝化功能建立完成后，在氨氮不超出系统负荷的情况下，其转化过程则不会再出现亚硝酸盐的积累。

许多研究和实际应用表明，硝化细菌、光合细菌和芽胞杆菌在水产养殖系统硝化功能建立过程中能够发挥重要作用。投加硝化细菌制剂能够加快硝化系统的建立，并且枯草芽胞杆菌和硝化细菌在水产养殖水质净化方面可以优势互补[13]。从实验结果看，投加硝化细菌制剂后，各系统亚硝酸盐氮峰值均明显低于氨氮初始浓度，表明投加制剂发挥了作用。加入光合细菌不仅可以净化水质，而且具有极高的营养价值，在作为饲料添加剂、防治鱼虾病害、促进鱼虾生长等方面均有较好的作用[14-15]。芽胞杆菌成为优势菌种后能产生枯草素等物质，能够抑制其他细菌的生长，减少甚至消灭病原体，改善和保持良好的养殖水环境[16-17]。

本研究结果显示，不同微生态制剂组合的硝化功能建立过程存在差异，投加硝化细菌+枯草芽胞杆菌的1 #系统硝化功能建立时间比投加硝化细菌+光合细菌系统的4 #系统时间短。研究表明，枯草芽胞杆菌代谢过程中产生枯草素等物质能有效抑制其他细菌繁殖，从而迅速成为优势菌，分泌的胞外酶可分解水中蛋白质、淀粉、脂肪等，产生的小分子物质能促进硝化细菌的化能合成作用[18]。光合细菌不能直接利用水中大分子有机物，必须先由其他微生物分解后才能被光合细菌分解利用，在硝化系统强化过程中，光合细菌成为优势种后，系统硝化强度高于硝化细菌+枯草芽胞杆菌系统，与刘军义等[19]研究结果相类似。

生物絮团技术(BFT)通过人为添加有机碳源，调节水体碳氮比，提高异养菌数量，利用微生物同化无机氮，将水体中氨氮等转化成菌体蛋白，形成可被滤食性养殖对象直接摄食的生物絮凝体，起到净化水质、减少换水量、节省饲料、提高养殖对象存活率及增加产量等作用[20-22]。其缺点是操作和管理过程较为复杂，在实际生产中稳定控制难度较大，如果调控不当，会造成氨和亚硝酸盐积累[23-24]。生物膜法是在养殖系统中添加微生物载体，利用附着生长的好氧菌、厌氧菌等控制水质，具有空间利用率高、抗冲击能力强等优势，可使养殖池同时具有对虾养殖和水质净化双重功能[25-27]。比较添加纤维毛球的1 #生物膜系统和2 #生物絮团系统硝化功能建立过程显示，生物膜系统有助于养殖系统硝化功能的快速建立，与张家松等[28]研究结果一致。在生物絮团养殖系统建立过程中，有机碳源作为异养菌的能量来源，对于提高异养菌数量以及生物絮团的形成至关重要[29-31]。研究发现添加碳源会加快投加硝化细菌+枯草芽胞杆菌的3 #系统硝化功能的建立过程，但添加碳源的3 #系统氨氧化强度低于未投加碳源的1 #系统，分析原因可能为投加有机碳源加快了枯草芽胞杆菌的繁殖，进一步通过溶解氧、生态位竞争等对硝化菌的生长繁殖产生抑制作用，从而降低了系统硝化强度。