上海市水产品副溶血性弧菌的污染情况及毒力基因分布

张玉洁 ， 孙晓红 *， 周彤彤 ， 赵 勇 ， 吴启华 ， 潘迎捷

（1.上海海洋大学 食品学院，上海 201306；2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心 农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（上海），上海 201306；3.美国USDA-ARS研究中心，美国加利福尼亚州 94710）

副溶血性弧菌是我国引起食物中毒的重要致病菌之一，人们食用生的、未完全煮熟或操作不当引起的副溶血性弧菌污染的水产品可引起腹泻、呕吐甚至死亡[1-2]。据卫计委统计数据显示，2013—2015年全国发生的微生物性食物中毒事件中，副溶血性弧菌是主要的病原之一[3-5]。美国CDC数据显示，每年美国发生大约7880起由弧菌引起的疾病中，有2800起病例是由食用污染副溶血性弧菌的食物引起。副溶血性弧菌的致病性与副溶血性弧菌的污染量和是否携带致病基因密切相关。研究发现，当致病性副溶血性弧菌污染水平高于1×103cfu/mL或1×104cfu/mL时，引发疾病的概率超过0.1%[6]。副溶血性弧菌的主要致病基因是溶血素相关基因，耐热直接溶血素 （thermostable direct haemolysin，tdh）和耐热相关溶血素（tdh-related haemolysin，trh）。 绝大多数从水产品中分离的副溶血性弧菌为tdh-trh-菌株，不具有致病性[6-7]。但对于tdh+/trh+阳性菌株而言，研究发现不同来源的副溶血性弧菌菌株携带毒力因子的种类可能不同[8-10]。Terzi等[8]研究发现鱼类来源的副溶血性弧菌未筛选到tdh+trh-菌株，而贝类来源副溶血性弧菌中未筛选到tdh-trh+菌株。

副溶血性弧菌广泛存在于河口、海洋、海水养殖池及各类海洋生物体内。近年来，副溶血性弧菌引起的食物中毒已高居微生物性食物中毒的首位，尤其是沿海省市[11]。为确定上海市近年来水产品中副溶血性弧菌污染情况，本研究中于2015年7月至2016年6月分别对来自海洋和市售2种途径的水产品进行了副溶血性弧菌的分离、国标法定量检测、分子鉴定及毒力基因的筛查，旨在调查上海市水产品中副溶血性弧菌污染情况，为加强政府监管，追溯其污染来源、污染途径提供重要基础数据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

水产品样品购自上海市铜川路水产批发市场、上海市军工路水产批发市场和上海市芦潮港码头，采样时间为2015年7月至2016年6月，每月采样2-4次，共采集206份水产品样品。

1.2 主要试剂和培养基

硫代硫酸盐柠檬酸盐-胆盐-蔗糖琼脂平板（TCBS）、胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基（TSB），北京路桥技术有限责任公司产品；科玛嘉弧菌显色培养基 （CV），法国科玛嘉 （CHROMagar）公司产品；BIOWEST regular agarose G-10，法国BIOWEST公司产品；TIANamp Bacteria DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司产品；引物、Permix Taq，宝生物工程（大连）有限公司；Bst DNA polymerase large fragment New England Biolab。

1.3 主要仪器设备

去离子水Milli-Pure，超纯水Milli-Q，美国Millipore Sigma公司；电热恒温水浴锅，上海申生科技有限公司产品；振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司产品；隔水式恒温培养箱，上海一恒科技有限公司产品；ESCO超净工作台，美国Airstream公司产品；Bio-Tek酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；产品Eppendorf离心机 5810R，美国Eppendorf公司产品；PCR仪，美国Eppendorf公司产品；DYY-6C型电泳仪，北京六一仪器厂制造；高压灭菌锅，日本TOMY KOGYO公司产品；微型振荡器，美国Fisher公司产品；Bio-Rad凝胶成像分析仪，美国伯乐公司产品。

1.4 实验方法

1.4.1 样品采集 每份样品的采集均进行独立包装，袋内打氧运输，2 h内送达实验室，进行样品预处理。

1.4.2 菌株的分离 按照国标GB/T 4789.7-2013，对副溶血性弧菌进行分离，选用硫代硫酸钠柠檬酸胆盐蔗糖培养基（TCBS）和科玛嘉弧菌显色培养基（CV）筛选疑似菌株。

1.4.3 MPN值计算 按照国标GB/T 4789.7-2013定量检测方法，取25 g样品至225 g APW中，拍打式均质机拍击2 min，将处理后的均质液进行10倍梯度稀释。接种环挑取最适梯度的稀释液，划线于TCBS平板及CV平板上，置于37℃恒温培养箱，培养18~24 h。根据《副溶血性弧菌最可能数（MPN）检索表》计算MPN值。

1.4.4 基因组DNA的提取 挑取疑似副溶血性弧菌单菌落接种于30 g/L氯化钠TSB液体培养基中，37℃、200 r/min，培养 3~4 h。按照 TIANamp Bacteria DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，Bio-Tek酶标仪测定基因组DNA的质量浓度。

1.4.5 毒力基因的PCR检测 以获得的基因组DNA为模板，副溶血性弧菌标准菌株33847为tdh阳性对照，副溶血性弧菌标准菌株17802为trh阳性对照，进行副溶血性弧菌的PCR鉴定（tlh）及其毒力基因tdh，trh的鉴定，引物序列及反应条件参照高玮等[12]。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行观察，取5.0 μL PCR产物点样于0.02 g/mL的琼脂糖凝胶中，180 V电压下电泳30 min，EB染色10 min，利用Bio-Rad凝胶成像分析仪观察结果，拍照获取琼脂凝胶电泳图谱。

1.4.6 毒力基因的LAMP检测 以获得的基因组DNA为模板，副溶血性弧菌标准菌株33847为tdh阳性对照，副溶血性弧菌标准菌株17802为trh阳性对照，进行副溶血性弧菌tlh基因、tdh基因和trh基因的LAMP检测，引物序列及反应条件参照韩小龙等[13-14]。LAMP产物用琼脂糖凝胶电泳进行观察，取3.0 μL LAMP产物点样于0.02 g/mL的琼脂糖凝胶中，180 V电压下电泳25 min，EB染色10 min，利用Bio-Rad凝胶成像分析仪观察结果，拍照获取琼脂凝胶电泳图谱。

2 结果与分析

2.1 不同类型水产品中副溶血性弧菌污染率

为了解上海市不同类型水产品中副溶血性弧菌的分布情况，2015年7月至2016年6月对采集的鱼、虾、蟹、贝4大类14种共206份水产样品进行副溶血性弧菌的定性和定量检测，结果如表1所示。206份水产样品中有182份样品检测出副溶血性弧菌，污染率达88.34%，其中污染率最高的水产品为虾类，污染率为95.18%（79/83），其次为蟹类（88.8%，8/9）、贝类（83.63%，92/110）。 根据国标 GB/T 4789.7-2013定量检测副溶血性弧菌的污染量，结果表明污染量最高的是虾类，为2156.57 MPN/hg，其次是贝类（84.78 MPN/hg）。可以发现草虾的污染率（100%）和污染量（5168.21 MPN/hg）均高于其他水产品种类。基围虾、斑节虾、牡蛎、梭子蟹等日常食用海鲜污染亦较为严重。

2.2 不同地点来源的水产品中副溶血性弧菌污染率

不同地点来源的水产品中副溶血性弧菌的分布状况不同，为了解其差异性，本研究中分别从上海市铜川路水产市场、上海市军工路水产市场和上海芦潮港码头采集206份水产品，副溶血性弧菌污染率如表2所示。水产品市场共采样135份，污染率为91.11%，MPN值为1361.76 MPN/hg。码头共采样71份海产品，污染率为83.09%，MPN值为88.36 MPN/hg。研究表明无论是污染率还是MPN值，水产品市场都远远高于码头。

2.3 不同季节水产品副溶血性弧菌污染率

为探究水产品中副溶血性弧菌的污染情况与季节之间的相关性，本研究中对不同季节采集的206份水产品进行副溶血性弧菌分析，其中夏季污染率高达97.33%，其次是秋季 （93.22%）、春季（80.55%），冬季相较于其他三季来说污染率较低，为69.44%。夏季是副溶血性弧菌生长繁殖的最适季节，因而MPN值也远高于其他3个季节，为1579.17 MPN/hg。

表1 不同种类水产品副溶血性弧菌污染率Table 1 Prevalence of V.parahaemolyticus in seafoods

表2 不同采样地点水产品中副溶血性弧菌污染率Table 2 Prevalence of V.parahaemolyticus in seafood purchased from market and wharf

图1 不同季节水产品副溶血性弧菌污染情况Fig.1 Prevalence of V.parahaemolyticus in different season

2.4 疑似副溶血性弧菌的PCR、LAMP鉴定

副溶血性弧菌在TCBS选择性培养基上菌落形态为圆形湿润绿色浑浊菌落，在CV板上为淡紫色圆形湿润菌落。通过2种不同的副溶血性弧菌选择性培养基共筛选，获得201株疑似副溶血性弧菌菌株。选取tlh基因，对疑似副溶血性弧菌分别进行PCR、LAMP鉴定，共鉴定出182株副溶血性弧菌株。部分疑似副溶血性弧菌株的鉴定结果如图2。

图2 部分菌株PCR-tlh及LAMP-tlh电泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of tlh PCR and LAMP products

2.5 副溶血性弧菌tdh基因和trh基因PCR、LAMP扩增结果

tdh、trh2个基因作为副溶血性弧菌的主要毒力基因，为了解其在水产品中的分布状况，采用PCR和LAMP 2种方法，以标准菌株ATCC33847作为tdh基因阳性对照，ATCC17802作为trh基因阳性对照，对182株副溶血性弧菌进行tdh基因和trh基因的扩增。结果显示共筛选出5株含有tdh或trh基因的副溶血性弧菌菌株，部分菌株tdh基因和trh基因PCR及LAMP检测结果如表3。

表3 部分水产品中分离副溶血性弧菌毒力基因检测结果Table 3 Prevalence of V.parahaemolyticus in seafood purchased from market and wharf

2.6 不同水产品中致病性副溶血性弧菌检出率

为了解不同类型水产品中致病性副溶血性弧菌的分布情况，对分离获得的182株副溶血性弧菌进行毒力基因的分析，结合菌株的来源分析致病性副溶血性弧菌在水产品中的分布，结果如表4所示。含tdh基因的副溶血性弧菌菌株3株，污染率为1.6%，含trh基因的副溶血性弧菌菌株2株，污染率为1.0%。3株tdh和2株trh阳性菌株均分离自虾，贝类、蟹类、鱼类均未分离出tdh+或trh+副溶血性弧菌菌株。

副溶血性弧菌作为沿海国家和城市爆发食源性疾病的首要致病菌，近几年，中国各地疾病预防中心对所在地水产品副溶血性弧菌检测越来越多[15]。本研究中从206份水产品中共分离鉴定出182株副溶血性弧菌，总污染率为88.34%。其中草虾污染量在所有水产品中最高，为5168.21 MPN/hg，高于虾类平均污染量一倍。无论是污染率还是污染量，虾类水产品都远远高其他水产品种类，污染情况较为严重。叶兵等[16]对2012年4—11月青岛市海产品副溶血性弧菌污染情况进行检测，副溶血性弧菌总污染率为20.39%，其中虾类污染率为23.8%，贝类为21.57%，虾类污染率高于贝类，与本研究结果相符。本研究中草虾均进口于泰国，Thongjun等[17-18]数据显示2006—2010年泰国南部副溶血性弧菌污染率较高且呈现逐步上升趋势，这也解释了本研究草虾的高污染率及高污染量。本研究中副溶血性弧菌总污染率高于其他研究，可能是因为采样种类的侧重不同，虾类和贝类样品数较其他种类来说较多，水产品产地污染率较高。

表4 不同种类水产品含tdh或trh基因副溶血性弧菌菌株检出率Table 4 V.parahaemolyticus strains containing tdh+/trh+genes in different seafood

本研究中在上海芦潮港码头收集71份样品，其中59份样品中分离出副溶血性弧菌，污染量为88.36 MPN/hg，而在上海市水产批发市场采样副溶血性弧菌污染率高达91.11%（123/135），污染量为1361.76 MPN/hg。水产品市场相对于自然环境而言具有更高的污染率和污染量，可能是市售水产品在运输、贩卖等环节因操作不当，造成副溶血性弧菌的交叉污染。彭少杰等[19]对上海2008—2010年上海市不同地点副溶血性弧菌污染的调查也发现农贸市场和批发市场的污染率、污染量均高于其他采样点。因此，除了保证源头的安全以外，从农场到餐桌等一系列流程都应该加强监管，主动监测，为控制和防御食源性疾病的发生提供评估数据。

采用TCBS和CV 2种副溶血性弧菌选择性培养基共分离出201株疑似副溶血性弧菌，通过LAMP鉴定182株确认为副溶血性弧菌，选择性培养基的假阳性为9.4%。陈志芸等[9]研究发现显色培养基假阳性结果为10.1%，与本研究结果一致。目前众多研究广泛使用MPN-PCR方法，Goh等[20-22]利用MPN-PCR的方法对肉类、蔬菜中的单增李斯特菌及副溶血性弧菌进行测定。本研究采用MPN、TCBS、CV、PCR、LAMP几种方法的结合使用， 确保了实验结果的可靠性，且LAMP较PCR而言更加简便省时，PCR又能防止LAMP的假阳性结果。

3 结 语

通过PCR和LAMP 2种方法对副溶血性弧菌主要毒力基因tdh、trh进行鉴定，182株副溶血性弧菌中含tdh基因的共有3株，含trh基因的共有2株，均来自于虾中。总污染率分别为1.6%、1.0%。其中虾类致病菌污染率达到 6.3%（tdh+：3.8%，trh+：2.5%，tdh+trh+：0%）。陈志芸等[11]结果显示上海市售海产品中副溶血性弧菌tdh、trh携带率分别为9.6%、1.0%，其中含有一株tdh、trh双阳性菌株（1%）。但Yingkajorn等[23-25]研究发现，从海产品中分离的副溶血性弧菌tdh/trh携带率为0%~4.5%，总体研究表明自环境分离致病性副溶血性弧菌携带率较低。