使用GC/MS和GC-O鉴定皖南烟叶主要呈香组分

倪 伟 ， 陈开波 ， 徐志强 ， 徐迎波 ， 周志磊 ， 毛 健 *

（1.安徽中烟工业有限责任公司 烟草化学安徽省重点实验室，安徽 合肥230088；2.江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡 214122；3.江南大学 食品安全与营养协同创新中心，江苏 无锡214122）

特色烟叶的开发是我国烤烟生产发展的重要方面，“焦甜香”近年来受到消费者和烟草行业的重视，其独特的香气十分适合生产中式卷烟的需求。皖南烟叶具有焦甜香的风格，表现为烟叶的香气浓郁，回甜感较强，香气浓郁，透发性好，具有浓香型的同时兼具焦甜香，是开发焦甜香型卷烟的理想材料。

烟叶香气和香气成分一直是烟草领域研究的热点之一，焦甜香是烤烟的典型香气之一。国内外研究人员对卷烟的焦甜香组分进行了探索。Matsukura等[1]通过柱层析对烟叶烘焙挥发物进行了分析，检测到了甲基环戊烯醇酮、麦芽酚、菠萝酮等几种具有焦甜香的成分。张启东等[2]分析了主流烟气粒相物水溶性组分中烤甜香成分，认为呋喃类、环戊烯酮类、呋喃酮类和吡喃酮类化合物对烤甜香有直接贡献。这些化合物均具有烯醇化平面结构单元，这种结构的化合物通常具有焦甜特征风味

[3]。通过分析化学成分与感官评分之间的相关性寻找香气的主要贡献物质是研究人员常用的方法之一。薛超群等[4]使用逐步回归分析了烟叶理化指标与焦甜感程度的相关性，发现糠醛、5-甲基糠醛、2-乙酰呋喃、香叶基丙酮是影响焦甜感程度的主要指标。一些研究人员探究了品种、气候条件、土壤、以及施肥等因素对皖南烤烟焦甜香的影响[5-9]。但是，总体来说人们对于皖南烟叶香气的主要贡献组分依然不明确。对于复杂基质，香气由多个化学组分贡献。如何在众多的化学成分中找出主要呈香组分是风味化学研究的热点和难点。气相色谱-质谱/嗅觉测量法（GC-MS/O）是解决这个问题的有效手段之一。在色谱流出物进质谱分析的同时以人的鼻子做为检测器，对流出峰进行气味特征和强度评价。它有效结合了气质联用仪高效分离、定性和定量的优势以及人鼻子灵敏度高的优势，可以帮助人们从复杂的混合物质中筛选出对香气有重要贡献的组分。

GC-O在食品、环保、医学、香妆品化学等多个领域应用广泛。但是目前其在烟草研究中的应用很少，仅有寥寥数篇文献。Higashi等[10]使用GC-O和预浓缩技术分析了卷烟侧流烟气的VOC，鉴定出30多个香气成分。Bazemore等[11]使用顶空固相微萃取（HS-HPME）和GC-O分析了雪茄消费者呼出的气体中的香气物质，发现吡啶类和吡嗪类物质是主要的呈香物质。随后Cotte等[12]建立了使用GC-O分析卷烟烟气的方法，鉴定了6个关键的呈香物质。国内研究人员也开始将GC-O用于烟草分析，陈丽君等[13]使用GC-O对烟草精油和津巴布韦烟叶的主要呈香物质进行了鉴定。随着近几年烟草行业对香型风格的重视及烟草风味研究的深入[14]，GC-O有望成为帮助研究人员揭示烟草香型和风格差异的重要手段之一。

本实验作者尝试采用气相色谱-质谱/嗅觉测量法（GC-MS/O）对皖南焦甜香烟叶中的主要呈香物质进行鉴定，为客观的进行焦甜香烟叶的筛选和评价提供借鉴和思考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 烟叶 皖南焦甜香型烟叶，由安徽中烟工业公司提供。

1.1.2 试剂 香味成分标准参照样：4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、苯乙醛、芳樟醇、β-二氢大马酮、香叶基丙酮、2-戊基呋喃、β-紫罗兰酮、苯乙酮、正己醛、苯乙醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮、甲基环戊烯醇酮、2-糠醛、苯甲醛、2-甲基四氢呋喃-3-酮、3-羟基-2-丁酮、2，3-戊二酮、二氢猕猴桃内酯、苯甲醛、反式-2-戊烯醛、5-甲基呋喃醛、吡啶、2-乙酰基呋喃、麦芽酚、2-甲基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪以及2-乙酰吡咯，内标为2-乙酸苯乙酯，以上试剂均为分析纯，购于百灵威科技有限公司（中国，北京）；溶剂为二氯甲烷（色谱纯），购自美国Tedia公司；无水硫酸钠（分析纯），购自国药集团化学试剂有限公司；实验中用到的其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器设备

SHZ型水循环真空泵，上海亚荣生化仪器厂制造；Trace ISQ气质联用仪，美国热电公司产品；RE-52AA型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂制造；ODP嗅辩仪，德国 Gerstel公司产品；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头（2 cm）及萃取装置，美国Supelco公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 样品的前处理 烟丝放入烘箱内，在40℃下干燥2 h，粉碎过40目筛。

1）顶空-固相微萃取。取1 g烟末，放入20 mL顶空瓶中，密封后在70℃平衡14 h，然后于相同温度下吸附60 min，萃取头为30/50 μm CAR/DVB/PDMS，然后于气相色谱进样口250℃解析6 min。

2）同时蒸馏萃取。称取25.0 g烟末置于SDE装置一端的1000 mL平底烧瓶中，并向其中加入350 mL饱和NaCl溶液，用调温电热器加热；装置的另一端接盛有60 mL二氯甲烷的250 mL圆底烧瓶，用 60℃的水浴加热；调节加热温度使水相和二氯甲烷相的馏出速度相等，萃取2.5 h；将二氯甲烷萃取溶液冷却至室温，加入适量的无水硫酸钠干燥过夜，过滤，滤液中加入 25 μL IS（186 μg/mL），40℃水浴中减压旋转蒸发浓缩到1 mL，再氮吹浓缩至0.1 mL进 GC-MS分析[15]。

1.3.2 标准物质的储备液、校正曲线溶液的制备分别准确称取一定量的标样，用二氯甲烷定容于50 mL容量瓶中制备成储备液。然后分别量取10、25、50、100、200 μL 和 500 μL 储备液于 50 mL 容量瓶中，加入12.5 mL内标储备液（使定容后内标质量浓度为46.5 μg/mL），使用二氯甲烷定容，制备成不同浓度梯度的标准物质混合溶液。

1.3.3 GC-MS检测条件 色谱条件，色谱柱：HPINNOWAX（30 m×0.25 mmi.d.，0.25 μmd.f.）毛细管色谱柱；进样口温度：240 ℃；载气：He；流速：1 mL/min；进样量：1 μL；分流比 10∶1；升温程序：从 50 ℃以4℃/min升温到200℃，再以8℃/min的升温速率升温到230℃并保持20 min；电离方式：电子轰击离子源（EI）；离子源温度：230 ℃；电离能量：70 eV；传输线温度：250℃；扫描方式：选择离子监测（SIM）和全离子扫描（Scan）模式；扫描范围：50~350 amu；溶剂延迟4 min。采用Nist质谱数据库检索结合标准物质进行定性分析，有标样的物质采用标准曲线定量，没有标样的物质忽略响应因子，假定目标物与内标的面积比等于浓度比进行近似定量[15]。

1.3.4 GC-O分析

1）SPME-强度法。使用SPME结合强度法对烟草香气成分进行评估，2个有经验的评价员参与实验，针对烟草香气物质对评价员进行额外的20个小时培训（每周4 h，共5周）。分析时，评价员对每个色谱峰进行嗅闻分析，进行香气特征和强度评价，5分代表非常强，4分代表比较强，3分代表中等强度，2分代表比较弱，1分代表很弱。

2）GC-O 和香气提取稀释分析（AEDA，aroma extract dilution analysis）。使用SDE处理的烟草样品进行AEDA分析，将样品按以下倍数进行梯度稀释：2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍…。记录每一个流出峰能够闻到气味的最小浓度（最大稀释倍数），即为该物质的稀释因子（FD）。

1.3.5 阈值测定 使用三点检验法测定单个物质的阈值，参照国标GB/T 12311-2012《感官分析三点检验》进行实验，使用纯水做参照样，将香气物质的稀溶液和参照样用三位随机数字编码，每3个杯子为1组，2组样品一起呈送给评价员，评价员需判定3个杯子中气味最强的一个，最终通过统计正确率得到阈值，评价员人数为32人。

1.3.6 数据的处理与分析 所有样品至少测定2个平行，结果以平均值±标准偏差的形式表示。方差分析（ANOVA）使用IBM SPSS19.0软件进行处理。

2 结果与讨论

2.1 使用GC/MS和GC-O分析皖南烟叶主要呈香组分

目前烟叶香气成分提取常用的方法是SDE，该法可以有效将香气物质从烟叶中提取出来，样品较干净，杂质少，该法的主要缺点是制样过程中需要长时间的加热过程，容易生成人工副产物。SPME是一种近年来发展起来的高效检测方法，制样简单，灵敏度高，受到研究人员的重视。但是该法对香气物质的富集程度不如SDE，不利于评价员在GC-O分析中评价色谱流出峰的香气。因此本研究使用SDE和HS-SPME 2种方法提取香味成分，结合GC-O对皖南烟叶主要呈香组分进行鉴定。

表1 皖南烟叶SDE样品GC/MS和GC-O分析结果Table 1 GC/MS and GC-O analysis results of tobacco leavesfrom southern Anhui extracted with SDE

续表1

由于SDE法制备的样品为溶液，选择香气提取稀释分析法（AEDA）进行GC-O分析，使用稀释因子（FD）表示每个物质的香气强度[16]。表1显示了SDE法烟叶香气物质GC/MS和GC-O分析的结果，共检测到了35个物质，其中26个物质能感受到香气。把稀释因子大于等于16的香气物质认定为主要香气物质，得到了7个主要呈香物质，包括：2-戊基呋喃、2-甲基-4氢呋喃-3-酮、2-糠醛、苯乙醛、香叶基丙酮、β-紫罗兰酮以及巨豆三烯酮。其中香气强度最大的是β-紫罗兰酮。SDE法样品制备需要高温长时间的加热过程，可能会有人为副产物生成，比如2-糠醛和2-甲基四氢呋喃-3-酮是糖裂解和美拉德反应的重要产物，二者的含量有可能被高估，因此有必要采用其他方法进行分析验证。

HS-SPME法的原理是将香气物质吸附在萃取头上进行富集再于气相进样口解吸附，因此不方便进行梯度稀释，在进行GC-O分析时，强度法是比较合适的选择，使用有经验的评价员对色谱流出峰进行香气特征和香气强度的评价[16]。表2显示了使用HS-SPME法提取烟叶香气物质的GC/MS-O分析结果，共检测到了36个物质，其中22个物质可以感受到气味，除了吡啶和己酸产生了令人不悦的气味外，其他物质均产生了令人愉悦的香气。共有10个物质的香气强度超过了3.0，包括：2-糠醛、芳樟醇、苯乙醛、茄酮、2-乙酰吡咯、麦芽酚、香叶基丙酮、β-紫罗兰酮、巨豆三烯酮和二氢猕猴桃内酯。其中香气强度最高的是香叶基丙酮和二氢猕猴桃内酯。与SDE法相比，HS-SPME法鉴定了更多的主要香气物质，其中2-糠醛、苯乙醛、香叶基丙酮、β-紫罗兰酮和巨豆三烯酮被2种方法鉴定为主要香气物质，说明这几种香气物质可能对皖南烟叶的香气有重要贡献。

表2 皖南烟叶HS-SPME样品GC/MS及GC-O分析结果Table 2 GC/MS and GC-O analysis results of tobacco leaves from southern Anhui extracted with HSSPME

2.2 使用香气重组法验证皖南烟叶主要香气组分

前面使用GC-MS结合GC-O得到了皖南焦甜香烟叶中的主要呈香组分，这种方法可以得到不同物质对烟叶香气的贡献大小，也评估了单个物质的香气特点。但是烟叶中含有多种香气物质，实际上这些物质之间可能存在复杂的相互作用，使用GCO也不能评估样品基质对香气物质的影响。因此，需要使用风味重组法对前述研究得到的主要香气组分进行验证，同时探讨每个香气物质在基质背景下对烟叶总体香气的影响。因此首先对前面得到的重要香气物质进行定量分析，一些标准物质的校正曲线参数如表3所示。

表3 皖南烟叶香气物质校正曲线参数Table 3 Calibration curves，correlation coefficients and linearity rangefor aroma compounds oftobacco leaves fromsouthern Anhui

由于烟叶为固体，在实际基质或者模拟体系下评估每个香气成分的贡献是比较困难的。本文中的阈值是香气物质在水溶液中的阈值，与实际体系可能会有偏差，但是这并不妨碍我们评估各个香气物质对烟叶香气的贡献大小。得到香气物质的质量分数之后，使用香气活度值（OAV，香气物质质量分数与阈值的比值）表征单个物质的香气贡献大小。表4列举了皖南烟叶香气物质的的质量分数、阈值和香气活度值（OAV），OAV值大于1的物质共有14个。其中OAV值最高的物质为4-乙烯基愈创木酚，苯乙醛、芳樟醇、β-二氢大马酮、香叶基丙酮、2-戊基呋喃以及β-紫罗兰酮的OAV值也比较高。这些物质均能产生令人愉悦的香气，4-乙烯基-2甲氧基苯酚能产生一种丁香、木香的香料味，而苯乙醛，芳樟醇，β-二氢大马酮、香叶基丙酮以及β-紫罗兰酮均能产生甜的果香，它们可能也对皖南烟叶的焦甜香有一定的贡献。2-戊基呋喃、甲基环戊烯醇酮和2-糠醛能产生焦甜香、面包香、烘烤香，他们可能是皖南烟叶焦甜香的重要贡献物质。此外巨豆三烯酮和茄酮没有得到商业可用的标样，无法通过感官方法对其进行验证和评价。但是GC-O实验中AEDA和强度法均发现二者有较强的香气强度，因此可以断定二者也是皖南焦甜香烟叶香气的重要贡献者。

表4 皖南烟叶香气物质质量分数、阈值及香气活度值Table 4 Content，threshold，and odor activity values of aroma compounds of tobacco leaves from southern Anhui

3 结 语

GC-MS/O是鉴定食品呈香组分的有效手段之一，本研究表明其在烟叶呈香组分鉴定方面也有较好的应用效果。本文作者结合GC/MS、GC-O和感官分析（阈值测定、香气活度值测定）鉴定了皖南烟叶的呈香组分，得到了16个主要呈香组分，除了茄酮和巨豆三烯酮由于没有商业标品无法验证外，其他呈香物质对皖南烟叶香气的贡献都得到了验证。本文是结合化学分析与感官分析方法对烟叶香气进行鉴定的初步探索，将来还需要进一步通过返添加或者模拟缺失实验确定单个香气物质对烟叶具体香气属性或者香型的贡献规律。