Th17相关细胞因子和趋化因子在天疱疮发病中的作用

叶珊珊 李莹洁 李 卉 姚香君 王再兴

天疱疮(pemphigus)是一种侵犯皮肤、黏膜的慢性自身免疫性大疱病，以患者血清中测得桥粒芯糖蛋白抗体为该病的主要特征[1]。Th17细胞是一种新型的T细胞亚群，作为免疫反应的主要效应细胞，在自身免疫性疾病、慢性炎症的发生中起着关键性作用[2]。目前已有许多自身免疫性疾病被报道与Th17有关，如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮及银屑病等[1]，但在天疱疮中的研究非常少见，相关的细胞因子与趋化因子在天疱疮中的作用也不清楚。本文通过检测患者血清中Th17细胞相关的细胞因子与趋化因子，探讨其在天疱疮发病中的作用机制。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2017年12月至2018年8月安徽医科大学第一附属医院皮肤科收治的31例天疱疮患者作为病例组，男15例，女16例，平均年龄(57.23±14.56)岁，经临床、组织病理和天疱疮自身抗体检测明确诊断分型的寻常型天疱疮18例(58.06%)，落叶型天疱疮7例(22.58%)，红斑型天疱疮6例(19.35%)。另选取明确诊断为大疱性类天疱疮(Bullous pemphigoid，BP)初发患者15例，男6例，女9例，平均年龄(67.20±10.87)岁及20名排除自身免疫性疾病、恶性肿瘤、感染等疾病的健康体检者作为对照组，其中男9名，女11名，平均年龄(52.75±13.50)岁。在31例天疱疮患者中，有23例患者疾病控制稳定后留有血清样本。

按照目前国际公认的天疱疮病情评估方法，即天疱疮面积指数(pemphigus disease area index, PDAI)，将患者入院时的皮肤及黏膜活动性的损害情况进行严重程度的量化分级，根据患者病情所获分值，分为轻度(0～8分)、中度(9～24分)、重度(≥25分)。其中轻度组6例(19.35%)、中度组15例(48.39%)、重度组10例(32.26%)三组。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集及处理 抽取31例治疗前和23例治疗后天疱疮患者、15例BP及20名健康对照者外周静脉血5 mL，静置沉淀2 h后，以3000 r/min的速度离心，5 min后吸取上层血清样本，置于-80℃冰箱保存以备检测。

1.2.2 实验方法 应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中Th17相关的细胞因子IL-6、IL-17、IL-21、IL-22、IL-23和趋化因子CXCL-8、CCL-5水平。实验严格按照试剂盒(Abcam产品，英国)标准操作程序进行。

2 结果

2.1 病例组与两组对照组细胞因子与趋化因子的比较 病例组与类天疱疮组及健康对照组两两比较发现，病例组血清中Th17相关细胞因子和趋化因子水平明显高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.001)；而病例组与类天疱疮组比较发现IL-21在两组间具有显著的差异性(P<0.05)，即病例组中IL-21水平明显低于类天疱疮组，而其它细胞因子未见明显差别(P>0.05)。见表1。

表1 三组细胞因子与趋化因子水平比较

注：*病例组与类天疱疮组比较，P<0.05，有统计学差异

2.2 不同亚型天疱疮患者血清细胞因子与趋化因子的比较 寻常型、落叶型、红斑型天疱疮三组间经方差分析比较，差异无显著性(P>0.05)。见表2。

2.3 不同严重程度的天疱疮患者血清细胞因子与趋化因子的比较 三种不同严重程度的天疱疮患者血清中Th17相关因子水平的统计结果显示：IL-17、IL-21、IL-22、IL-23、CCL-5与疾病严重程度显著相关(P<0.05)；并且血清IL-23水平在三组间比较具有明显差异，且疾病程度越重，细胞因子表达水平越高，差异有统计学意义(P<0.05)；IL-6、CXCL-8差异无统计学意义(P>0.05),见表3。

2.4 天疱疮患者治疗前后细胞因子与趋化因子的比较 在天疱疮患者治疗前后血清中Th17相关细胞因子与趋化因子的比较发现，IL-6、IL-10、IL-17、IL-21、IL-22、IL-23和CXCL-8均较治疗前呈现明显下降趋势(P<0.001)，而CCL-5水平也有下降，但不显著(P>0.05)。见表4。

表2 不同亚型天疱疮患者血清细胞因子与趋化因子的比较

表3 不同严重程度的天疱疮患者血清细胞因子与趋化因子的比较

注：*P<0.05,差异有统计学意义

表4 治疗前后细胞因子与趋化因子水平比较

3 讨论

天疱疮是一种自身抗体导致的皮肤疾病，在患者血清和皮损处检测出针对桥粒芯糖蛋白1和 3(desmoglein，Dsg1和Dsg3)特征性IgG自身抗体，B细胞产生致病性抗体是引起棘层细胞松解，皮肤、黏膜出现特征性水疱的关键因素，而T细胞亚群及其相关因子在诱导和维持天疱疮抗体的产生中起着重要作用[1]。近年来，新型CD4+亚群Th17细胞被发现参与了多种自身免疫性疾病的发病过程而逐渐受到关注。直至2008年，Arakawa等[2]通过免疫组化染色试验，发现天疱疮患者皮损中Th17细胞及其细胞因子IL-17呈现高度表达状态，首次揭开了探讨Th17细胞及相关因子在天疱疮发病机制研究的序幕。

Th17细胞是一种分泌特征性IL-17的辅助T细胞亚群[3]。初始CD4+-CD161+Th细胞在特异性的细胞因子，如TGF-β、IL-6、IL-1β、IL-21、IL-23协同作用下激活STAT3信号传导途径，诱导RORγt的过度表达，从而促进Th17细胞的分化和细胞因子IL-17、IL-22的产生[4]。趋化因子作为一种调节细胞运输、控制免疫细胞迁移的信号肽[5]，与Th17细胞介导组织炎症和自身免疫性疾病的发生密切相关。目前，国内对趋化因子在天疱疮中的作用尚无相关研究。

体内B细胞分泌主要的自身抗体IgG1和IgG4，与表皮结构蛋白相结合后可能直接诱导水疱的形成，或间接激发炎症通路，包括补体激活、白细胞向病灶聚集、大量蛋白酶释放导致皮损的发生[6]。IL-6是一种炎性细胞因子，参与炎症反应，诱导B细胞增殖、终末分化及免疫球蛋白的分泌[7]；而IL-21作为Th17细胞自分泌细胞因子，与IL-4协同后可诱导CD40L刺激性B细胞产生IgG1抗体[8]从而发挥致病作用。我们实验结果与既往研究一致的是，在天疱疮患者血清或皮损检测到IL-6、IL-21的强阳性表达[9，10]，两种因子或许也可在细胞免疫阶段促进B细胞抗体分泌，致高浓度的抗Dsg抗体产生而导致天疱疮的发病。IL-21促进了Th17作用，同时也抑制幼稚CD4+T分化为Treg细胞的能力，致使两种细胞失衡[11]；另有研究表明，刺激离体Dsg3后也检测到了分泌IL-21的特异性自身反应性T细胞[10]，这些发现均提示与疾病的发生有关。

IL-17是Th17细胞最重要的效应因子，为T细胞诱导炎症反应早期的启动因子，活化后的T细胞产生的CCL-5/RANTES具有很强的募集单核细胞、Th1、Th17和嗜酸粒细胞的能力,从而诱导炎性因子的过度表达[12]，而与炎症反应过程中产生的CXCL-8/IL-8共同作用下，可募集中性粒细胞趋化至炎症部位[13]；在我们的实验中，也发现天疱疮患者血清中三者均有不同程度的升高，这或许可在一定程度上解释天疱疮病理中见真皮浅层中性粒细胞、嗜酸粒细胞等浸润的原因。而有学者认为，IL-8的增加可能不是导致天疱疮形成的直接原因，是皮肤屏障受损后炎症反应的结果[1]。但也有研究表明，在表皮中炎症因子和趋化因子的过度表达，如IL-6、CXCL-8、MCP-1可导致中性粒细胞活化，细胞内活性氧(ROC)的释放，导致真皮表皮交界处的破坏[14]。在皮肤中，IL-22介导表皮的增生、脱落，角质形成细胞的增殖和终末分化等生物学过程。同时有研究发现， CCL-5与IL-22具有相互抑制现象[15]，但在我们的研究中，并未体现这一特点。曾有学者发现天疱疮患者治疗后，IL-22的水平呈现上升趋势[16]，并且不同以往的研究[15，17]，IL-22在不同亚型比较也未发现明显的差异性，这或许与本实验样本量有限有关，目前还需扩大样本数量作深入研究。

IL-23不仅是启动Th17细胞分化的关键因素，也是增强Th17扩增、稳定细胞、维持功能、发挥慢性炎症反应的重要因子[5]。Timoteo等[17]在天疱疮患者血清中同样发现IL-23水平升高，并且伴随IL-6与IL-17的表达增强，这与我们的发现一致。而在我们的研究中，IL-23不仅在天疱疮患者血清中明显升高，并且与疾病的严重程度呈正相关，提示其表达水平可用于评估天疱疮的严重程度。有人提出，Th17细胞的致病性与IL23/IL23R信号通路过度激活有关[18]。或许，IL23/Th17轴可能是揭示天疱疮发病机制的新途径[19]，为天疱疮的治疗提供最有希望的靶点之一。

综上所述，我们通过研究发现Th17相关细胞因子和趋化因子在天疱疮等自身免疫性疱病中呈异常表达，并且在疾病控制稳定后细胞因子水平呈现下降的趋势，因而认为它们可能在介导炎症反应、趋化效应细胞，以及诱导B细胞分化特异性抗体等方面，参与疾病的发生。部分因子水平与天疱疮严重程度具有一定相关性，这也提示着Th17相关因子与疾病状态有关，并且IL-23的表达差异有助于判断天疱疮的严重程度，为临床的诊断治疗提供了重要依据。

在后续研究中，我们拟进一步检测天疱疮皮损及疱液中Th17相关因子的水平，并分析天疱疮特异性抗体与分子水平的相关性，对Th17相关细胞因子在天疱疮发病中的作用进行深入研究。