金银花中酚酸类有效成分的提取及其抗菌活性研究

1.广西中医药大学，广西 南宁 530200；2.佳木斯市食品药品检验检测中心，黑龙江 佳木斯 154002；3.东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030；

金银花是忍冬科多年生常绿缠绕灌木忍冬(LonicerajaponicaThunb. )的干燥花蕾[1]。具有清热解毒、抗菌消炎、保肝利胆的功能，临床主要应用于疮疡、泻痢、外感、热病及呼吸道感染等疾病[2-3]。研究表明，金银花中主要含有挥发油类、黄酮类、酚酸类、三萜类等成分，其中酚酸类成份具有较好的抑菌效果[4-5]。研究以酚酸类为指标考察金银花的最佳提取方法，并对其提取物进行抗菌活性考察，为金银花在细菌感染疾病的治疗提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 高压灭菌锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)、恒温振荡培养箱(中国哈尔滨东联电子技术开发有限公司)、分析天平(上海精密科学仪器有限公司)、移液枪(Eppendorf)、TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

1.2 材料 绿原酸对照品购自(中国药品生物制品鉴定所)，金银花购自北京同仁堂，枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌均购自美国菌种保藏中心。

2 方法

2.1 改良石硫法提取金银花 取金银花50 g，加15倍量水，浸提2 h，过滤，滤渣再加10倍量水浸提1.5 h，过滤，合并滤液，浓缩，缓缓加入20%的石灰乳调pH值至10左右，离心，沉淀物，加入2倍量95%乙醇研磨成浆，加50%硫酸调pH值至3左右，充分搅拌，离心，离心液加40% NaOH调pH值至6左右，回收乙醇，减压烘干，得粗提物。

粗提物溶于2～3倍量水中，盐酸调pH值至2，乙酸乙酯萃取数次，萃取液用活性碳脱色，过滤，滤液浓缩后，分次加入适量氯仿，过滤沉淀，常压干燥，得淡黄色浸出物并计算浸出物含量。

2.2 水提正丁醇萃取法提取金银花 取金银花50 g，加10倍量水，80 ℃浸提2次，每次2 h，过滤并合并滤液，浓缩，浓缩液用50%硫酸调pH值至3，正丁醇萃取3次，合并萃取液，调pH值至6～7，减压回收，浓缩干燥，得淡黄色浸出物并计算浸出物含量。

2.3 乙醇回流提取法提取金银花 取50 g金银花，加10倍量50%乙醇，80 ℃加热回流2次，每次1 h，过滤并合并滤液，减压浓缩，调浓缩液pH值至2左右，加乙酸乙酯萃取，合并萃取液，并用适量水洗涤2次，以40%NaOH调pH值至6～7，取水层减压浓缩至稠膏，再干燥，得浸出物并计算浸出物含量。

2.4 水提醇沉法提取金银花 取50 g金银花，加10倍量水，80 ℃浸提3次 ,每次1.5 h，过滤，滤液减压浓缩，加入乙醇，冷藏24 h，滤过，滤液减压真空干燥，得浸出物并计算浸出物含量。

2.5 酚酸类成分的含量测定

2.5.1 绿原酸标准曲线制备 精密称取绿原酸标准品1 mg置于10 mL容量瓶中，娃哈哈纯净水定容，并稀释配制成浓度为1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 μg/mL 的标准品溶液，以中国药典规定的324 nm为测定波长，测定吸光度(A)，以吸光度值A为纵坐标，绿原酸浓度C作为横坐标建立标准曲线，得到线性回归方程。

2.5.2 精密度测定 取绿原酸对照品溶液(5.0 μg/mL)6份，按2.5.1测定方法连续测定，记录 A值，计算RSD值。

2.5.3 重复性实验 分别精密称取5 mg提取物样品6份，加至10 mL容量瓶中，娃哈哈纯净水定容，按2.5.1测定方法连续测定，记录 A值，计算RSD值。

2.5.4 加样回收率测定 分别精密称取16 mg已知含量的提取物样品(绿原酸含量100 μg)6份，至50 mL容量瓶中，加入绿原酸对照品100 μg，加水定容，按2.5.1测定方法测定A值，并计算平均回收率与RSD值。

2.5.5 稳定性测定 取样品溶液(绿原酸20 μg/mL)5mL，按2.5.1方法测定A值，每隔15 min测定一次，测定2 h，计算RSD值。

2.5.6 酚酸类成分的含量测定 精密称取各提取物5 mg，置于10 mL的容量瓶中，娃哈哈纯净水定容，再精密吸取溶液1 mL，置于10 mL的容量瓶中，娃哈哈纯净水定容，得到供试品溶液。将供试品溶液在324 nm 波长下测定 A，计算各提取物中酚酸类成份的含量。

2.6 金银花提取物的抑菌效果考察 分别取枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌悬液各0.2 mL，注入无菌培养皿内，加入15 mL琼脂培养基，混匀，冷却制备含菌平板，将每个含菌平板均分成4等份，每份正中处轻放一无菌牛津小杯，在牛津小杯中分别注入浓度为30%的不同金银花提取物水溶液，36 ℃培养24 h，测量每个牛津小杯所对应的抑菌圈直径。

3 结果

3.1 酚酸类成分测定的方法学考察 以浓度C为x轴，吸光度A为y轴绘制标准曲线，其线性回归方程为C=0.0371A+0.0098，r=0.9997，表明绿原酸在1～9 μg/mL 的浓度范围内线性关系良好。精密度实验、重复性试验及稳定性实验中的RSD值分别为0.33%、0.54% 和0.99%，均符合药典规定，表明此方法的精密度、重复性良好，且2 h内药物稳定。此外，本测定方法的平均加样回收率为97.14%，RSD值为1.30%，表明此方法准确度良好。以上实验结果均表明此方法符合药典标准，可用于酚酸类成分的含量测定。

3.2 金银花提取方法考察 由表1可知，水提醇沉法制得的浸出物含量最高，而改良石硫法制得的浸出物含量最低；以酚酸类成分的含量为考察对象，则改良石硫法的总酚酸含量最高，乙醇回流提取法次之。其中改良石硫法，水提正丁醇萃取法和水提醇沉法均为水提，但是结果却相差甚大，说明酚酸类成分在3种提取方法的纯化步骤中损失差异较大。

提取物改良石硫法水提正丁醇萃取法乙醇回流提取法水提醇沉法浸出物含量/%11.40±0.02618.09±0.3537.49±0.7164.681±0.29酚酸类含量/mg/g68.87±1.2542.83±3.2764.32±0.8516.68±0.97

3.3 金银花提取物抑菌效果 由表2可知，除改良石硫法和乙醇回流提取法制备的金银花提取物对枯草芽孢杆菌的抑菌效果无显著性差异外，不同提取方法制得的金银花提取物对同一菌株的抑菌效果均具有显著性差异，且改良石硫法制得的金银花提取物对4种细菌的抑菌圈直径均为最大，表明此法制得的提取物抑菌效果最好。在表1中改良石硫法制得的金银花提取物中酚酸类含量最高，而酚酸类能够引起细胞膜损伤，进而导致胞内蛋白质、ATP 等大分子物质泄漏，膜电位破坏，最终具有抑菌、杀菌效果。本研究结果表明表2与表1结果一致，均表明改良石硫法制得的金银花提取物具有最佳的抑菌效果。

细菌改良石硫法水提正丁醇萃取法乙醇回流提取法水提醇沉法枯草芽孢杆菌2.41±0.035a2.09±0.020b2.41±0.036a1.90±0.031c金黄色葡萄球菌2.61±0.025a2.22±0.025b2.42±0.031c1.83±0.021d大肠杆菌3.47±0.042a2.60±0.035b2.40±0.020c2.20±0.035d绿脓杆菌2.72±0.049a2.25±0.050b2.63±0.025c1.91±0.031d

4 结论

实验分别考察了改良石硫法、水提正丁醇萃取法、乙醇回流提取法和水提醇沉法制得的金银花浸出物含量，测定了各提取物中酚酸类成分的含量，并评价了各提取物对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌的抑菌效果。结果表明，水提醇沉法的浸出物含量最高，但其酚酸类的含量最低、抗菌活性最差，改良石硫法制得的金银花提取物中酚酸类成分含量最高、抗菌效果最佳。因此，治疗细菌感染性疾病可用改良石硫法制备金银花提取物。