分散固相萃取法结合UPLC-MS/MS同时分析茶叶中13种杀菌剂

黄 彪，刘文静，吴建鸿

（福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/福建省农产品质量安全重点实验室，福建福州 350003）

1 前言

在农业领域，杀菌剂主要是指用于防治由各种病原微生物引起的植物病害的一类农药。杀菌剂能很好的防治植物病害，起到保护植物、促进生产的作用，被广泛应用于农作物的种植过程。由于农药残留的潜在危害，许多国家及国际组织都对农药残留严格规定了残留限量[1-2]。我国茶叶品种资源多，种植区域广，茶树在种植过程中从叶、茎、根到花等均可能有病虫危害，因此杀菌剂在茶叶的种植过程中应用较多，国际贸易中对农产品中农药残留最高限量的规定越来越严格，有关茶叶的农药残留限量标准也更为严苛，而我国一直以来是重要的茶叶出口大国，因此研究茶叶中杀菌剂残留的检测方法具有非常重要的意义。

快速、高效的农药残留分析方法能否建立在很大程度上取决于样品前处理过程，高效的前处理技术往往能大大减少分析的成本和时间。目前，农产品中杀菌剂的检测常见前处理方法有液液萃取、固相柱萃取、分子印迹固相萃取及分散固相萃取等[3-7]。分散固相萃取技术相比于其他前处理方法具有溶剂用量少，提取速度快，重现性好等优点，在样品前处理过程中得到广泛应用。杀菌剂的检测方法主要有毛细管电泳法[8]、气相色谱法[9-10]、液相色谱法[11-12]、气相色谱-串联质谱法[13-14]、液相色谱-串联质谱法[15-17]等。

质谱检测技术因其抗干扰强，检测快速，灵敏度高，定性定量准确等优点，已逐渐发展成为分析检测中的主导技术，而尤其是超高效液相色谱-串联质谱分析技术，将超高效液相色谱仪对复杂样品的快速分离能力与质谱仪对目标离子的高选择性、高灵敏度相结合，在食品安全、药物分析、环境监测等领域中越来越发挥出重要作用。在已有报道中，利用分散固相萃取结合超高效液相色谱-串联质谱法检测茶叶中杀菌剂残留的报道尚不多见。本研究利用分散固相萃取法前处理净化，建立了超液相色谱-串联质谱法分析茶叶中杀菌剂残留。该方法样品前处理时间短，分析快速，准确性好，可为茶叶杀菌剂残留定性定量分析提供方法参考依据。

2 材料与方法

2.1 仪器与试剂

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Xevo TQ-S三重四极杆质谱仪（美国Waters公司）；样品均质器（德国IKA公司）；SYG-2水浴恒温振荡器（常州朗越仪器有限公司）；XW-80A旋涡混合器（上海医科大学仪器厂）；Millipore Qirect-Q5超纯水设备（美国Millipore公司）。

乙腈（色谱纯，美国Waters公司）、甲醇（色谱纯，美国Waters公司）、乙酸铵（LC-MS级，美国 Waters公司）、甲酸（LC-MS级，美国Waters公司）、N-丙基乙二胺（PSA，40 μm，天津博纳艾杰尔科技有限公司）、C18吸附剂（40-60 μm，天津博纳艾杰尔有限公司）、超纯水（Millipore超纯水机制备），其他试剂为分析纯。

2.2 标准溶液的配制

氟硅唑、丙环唑标准品（纯度97%，德国DR公司），用乙腈溶解配制成浓度为1 000 mg/L的标准储备液；三唑酮、苯醚甲环唑、多效唑等农药标准液购于国家标准物质中心，浓度规格为1 000 mg/L。标准品储备液置于-20℃冰箱中保存，实验时取储备液配制成10 mg/L的单标中间液，用空白基质溶液配制的用于制作标准曲线的不同浓度的混标工作液，现配现用。

2.3 样品前处理方法

准确称取5.00 g（精确至0.01 g）磨碎的茶叶样品于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，用均质器以15000 r/min均质提取1 min后，盖好盖子振荡提取15min，以 8 000 r/min离心5 min；转移上清液2.0 mL到预先加有50 mg PSA，50 mg C18，10 mg石墨化炭黑GCB的10 mL离心管中，涡旋30 s后，8 000 r/min离心1min；取上清液过0.22 μm 滤膜，滤液供UPLC-MS/MS分析。

2.4 色谱-质谱条件

超高效液相色谱条件：Waters T3 C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm，）；柱温：30.0℃；梯度洗脱：流动相A为0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸铵水溶液，流动相 B 为乙腈；0～3 min，90%～70%A ；3～5 min，维持 70%A；5～8 min，70%～20%A；8～10 min，20%～90%A；流动相流速：0.2 mL/min；进样量：4 μL。

质谱条件：电喷雾ESI+扫描方式；检测方式：多反应监测（MRM）模式；毛细管电压：2.5 kV；锥孔气流：氮气，流速50 L/h；脱溶剂温度：150℃，流速 800 L/h；离子源温度：150 ℃；雾化气压力：0.28 MPa；碰撞气：高纯氩气。相关质谱检测参数见表1。

3 结果与讨论

3.1 色谱-质谱条件的优化

在实验过程中，比较了以甲醇-水和乙腈-水作为流动相以及在流动相中添加甲酸、乙酸铵对目标化合物的分离效果及目标离子色谱峰峰型的影响。实验结果表明：采用乙腈-5 mmol/L乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸）作为流动相时，在正离子扫描模式下，杀菌剂有良好的峰形且相对于不加甲酸的流动相有更好的响应强度，甲酸的加入有利于目标分子更好的形成正离子，5 mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸水溶液缓冲体系在一定程度上可以调节体系的pH值，使得在一个合适的酸碱性范围内目标离子有更好的峰型。

3.2 提取溶剂的选择

在农药目标分子的前处理过程中，常用的萃取溶剂有甲醇、乙腈、乙酸乙酯等。甲醇虽对农药分子有很好的溶解性，但甲醇是一种质子性溶剂在提取农药分子的同时也很容易将样品中的醇类、多酚、有机酸等物质提取出来。茶叶样品中既有较多的茶多酚等物质，同时也含有没食子酸等一些有机酸物质，采用甲醇作为提取茶叶样品中的农药分子，会对后续的净化过程造成一定的影响。乙睛作为一种极性较大的溶剂、穿透力强，对农药分子的提取效率高，并且用乙腈作为提取溶剂可以减少维生素、色素等中等极性杂质的溶出，因此被广泛用于残留分析中目标分子的提取。如用乙酸乙酯作为提取溶剂，最后需氮吹转溶剂为乙腈或者甲醇进行液相色谱-质谱分析，会使得前处理时间变长。因此综合考虑，采取乙腈作为提取溶剂。

表1 13种杀菌剂检测的质谱参数

3.3 分散固相萃取剂的选择

在样品前处理过程中常用的固相萃取剂有PSA、C18及GCB。PSA是含有氨基基团的强极性分子，能够通过强的吸附及离子交换过程将与基质中的多酚、有机酸、糖类等含有羟基或者羧基的极性分子除去。C18由于分子中键合十八烷基，对极性较小的分子具有良好的吸附作用，能够去除基质中的色素、维生素等物质。GCB则对色素有良好的去除能力。考虑到茶叶基质中有茶多酚、有机酸、维生素及色素等物质，因此在实验中考虑将上述吸附剂进行组合对样品前处理净化。在实验中以茶叶样品为基质加入50 μg/kg混标溶液，考察了不同用量固相萃取剂的净化效果及回收率情况：（1）25 mg PSA+25 mg C18+10 mg GCB（2）50 mg PSA+50 mg C18+10 mg GCB（3）75 mg PSA+75 mg C18+10 mg GCB。实验结果表明：以乙睛为提取溶剂的情况下，第（2）、（3）两种吸附剂综合使用效果都较好,能够较好的对样品前处理去除杂质，并且目标分子的回收率均在75%以上。另外也考察了PSA和C18用量不变时，改变GCB用量净化效果的不同：（4）50 mg PSA+50 mg C18+5 mg GCB （5）50 mg PSA+50 mg C18+10 mg GCB（6）50 mg PSA+50 mg C18+15 mg GCB。实验中发现，加入 10 mg GCB即可很好的去除色素等杂质。因此，综合考虑实验成本、净化效以及对回收率的影响，实验中采用50 mg PSA+50 mg C18+10 mg GCB吸附剂组合进行样品的净化处理。

3.4 方法评价

将空白样品经固相萃取剂分散提取得到基质净化液，配制13种杀菌剂的基质匹配混标溶液，注入超高效液相色谱-串联质谱仪进行分析。以目标物特征离子色谱峰响应信号峰面积（y）为纵坐标，目标化合物的基质匹配溶液浓度（μg/L）x为横坐标，制作标准曲线。依据特征离子色谱峰信号的3倍信噪比（S/N≥3）确定方法的检出限，根据各目标化合物的响应情况在茶叶基质中进行低、中、高3个浓度水平的加标。结果表明：13杀菌在0.5 μg/L～100 μg/L浓度范围内基质匹配曲线线性关系良好（r≥0.995)，方法灵敏度高，目标化合物的检出下限在 0.08～0.7 μg/kg之间。不同浓度水平加标相应平均回收率为70.1%～106.7%，相对标准偏差在 1.2%～7.6%之间（表 2）。

4 实际样品的检测

采集茶叶样品40余份进行了杀菌剂残留的分析，发现1份茶叶样品中有苯醚甲环唑残留，含量为0.056 mg/kg，阳性样品的MRM离子色谱图如图1所示。虽有检出，但未超出食品安全国家标准限量规定（标准规定茶叶中苯醚甲环唑最大残留限量为10 mg/kg）[2]。

图1 阳性样品的苯醚甲环唑MRM离子色谱图

表2 13种杀菌剂的平均加标回收率和检出限（n=6）

5 结论

本研究运用分散固相萃取前处理法结合超高效液相色谱-串联质谱法，建立了茶叶中多菌灵、三唑酮、腈菌唑、苯醚甲环唑等13种杀菌剂残留的检测方法。该方法前处理简单，方便快速，具有良好的灵敏度、准确度和精密度，可用于茶叶中杀菌剂残留的同时分析，有利于农产品质量安全的保障。