烟草糖酯SSR分子标记筛选及辅助育种应用

陈彪　陈铭　李洋洋　屈亚芳　程立锐　杨爱国　胡日生　刘旦　罗成刚　向世鹏　冯全福　常爱霞

摘  要：为明确与糖酯紧密连锁的SSR分子标记在烟草实际育种工作中的可用性，加快烤烟糖酯遗传改良进程，本研究利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术和GC-MS检测技术，以不同遗传背景的5个烟草种质以及192份重组自交系遗传群体为试验材料，对5个SSR分子标记开展了筛选和验证研究。结果表明，5个分子标记中，PT20315、PT30354两个分子标记在不同遗传背景中多态性稳定，并且其多态性条带与糖酯表型差异的对应性较好;在重组自交系群体中，两个分子标记鉴定的基因型与糖酯表型的一致率分别为93.75%和90.58%，可用于高糖酯烟草分子辅助育种中。目前，利用两个分子标记辅助选择，已经定向改良获得高糖酯K326等新品系材料。

关键词：烟草;糖酯;分子标记;辅助育种

中图分类号：S572.03          文章编号：1007-5119（2019）03-0008-08      DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.03.002

In order to clarify the usability of SSR molecular markers closely linked to sugar esters in the actual breeding of tobacco， and to accelerate the genetic improvement of flue-cured tobacco sugar esters， in this study， using polyacrylamide gel electrophoresis and GC-MS detection techniques， 5 tobacco germplasms with different genetic backgrounds and a genetic population with 192 recombinant inbred lines were used as experimental materials for screening and testing of 5 SSR molecular markers. The results showed that， among the 5 molecular markers， the polymorphisms of 2 molecular markers PT20315 and PT30354 were stable in different genetic backgrounds， and the correspondence between their polymorphic bands and the phenotypic difference of sugar esters were better. In the recombinant inbred line population， the consistency rate between the genotypes identified by the 2 molecular markers and phenotypes of sugar esters reached 93.75% and 90.58% respectively. The 2 molecular markers could be used in the molecular-assisted breeding of high-sugar ester tobacco. Currently， using of the 2 molecular markers in assisted selection has directionally improved new lineage materials such as high sugar ester K326 etc.

： tobacco; sugar ester; molecular marker; assisted breeding

煙草糖酯是烟叶表面化学重要组成成分之一，由烟草腺毛的腺头特异合成，是腺毛分泌物中除二萜外，含量最丰富的成分。糖酯具有抗虫、抗菌、抗氧化、防止老化等多种生物功能，也是烟草重要的致香前体物质，其降解产生的小分子挥发性脂肪酸，对烟叶香气品质具有重要贡献。

此外，糖酯类化合物也是烟用香料的重要组成部分之一，加到烟丝上可起到增香保润作用，该类化合物作为挥发性香味成分前体物已经得到国内外烟用香精香料行业研究人员的认可和重视。因此，通过多种途径提高烟叶表面糖酯含量，对改善烟叶香吃味品质及提高烟叶抗性均具有重要意义。在众多途径中，培育高糖酯含量的新品种是最经济有效的手段。

已有研究表明，栽培烟草中的糖酯类型主要是蔗糖四酯，一般分为6个型（蔗糖酯Ⅰ-Ⅵ型，其中Ⅲ-Ⅵ型蔗糖酯含有3-甲基戊酰，称为BMVSE），不同类型烟草中蔗糖四酯的类型及含量有较大差异。烤烟、白肋烟、马里兰烟中一般含有少量的Ⅰ-Ⅱ型蔗糖酯以及痕量（或几乎没有）的Ⅲ-Ⅵ型蔗糖酯，而大多数香料烟和许多雪茄烟品种中含有大量的BMVSE。遗传研究表明，烟草BMVSE的遗传受单显性基因控制。2010年，VONTIMITTA等利用SSR分子标记对调控BMVSE的基因进行了遗传定位，结果表明，有2个SSR标记PT30209、PT20315与BMVSE完全共分离，PT30354与PT52061+PT61362分布于基因两侧，紧密连锁，遗传距离分别为3.9 cM与1.3 cM。长期以来，烟草育种中提高糖酯含量的研究，多是靠气相色谱法（GC-MS）等仪器检测，由于费用较高、前处理过程复杂繁琐，大大限制了含有多类型糖酯的优良中间世代材料的选择进度。这些BMVSE分子标记的获得，为烟草BMVSE糖酯分子标记辅助育种奠定了很好的基础。但是，这些分子标记主要是基于雪茄烟品种Beinhart-1000和烤烟品种Hicks杂交构建的加倍单倍体遗传群体获得，是否能在其他品种的杂交分离群体中辅助选择利用、哪些标记能够利用等，目前尚未知。

当前烤烟主栽品种中均不含BMVSE，利用连续回交的手段向这些品种中快速定向导入BMVSE，是丰富其表面分泌物糖酯类型和含量、改善其香气品质、培育特色高香气烤烟品种的重要途径之一。为加快BMVSE向主栽烤烟品种中的定向改良进程，

本研究对5个BMVSE分子标记进行了筛选和验证，从中筛选出了带型清晰、种质间差异明显的标记，用于BMVSE向烤烟定向回交转移时辅助选择。本研究结果对多类型糖酯种质资源的鉴定，以及向烤烟、白肋烟、马里兰烟等不含BMVSE的烟草类型中快速定向转移BMVSE，均具有很好的借鉴意义。

1  材料与方法

1.1  供试材料

供试烤烟品种K326、红花大金元和小黄金1025，香料烟Samsun和雪茄烟Beinhart 1000-1等由中国农业科学院烟草研究所烟草种质资源中期库提供。雪茄烟Beinhart 1000-1和小黄金1025为亲本构建的RIL群体（F7）以及K326、红花大金元等主栽品种定向改良遗传群体材料，均由课题组创建获得。

本研究2016年完成分子标记初筛和RIL群体验证;2016—2018年，多态性分子标记应用于课题组创建的BMVSE定向转移K326和红花大金元回交群体，技术线路如图1。

1.2  试验方法

1.2.1  DNA提取  参照CHEN等的SLS法分别提取供试材料鲜烟叶全基因组DNA。

1.2.2  PCR反应  PCR反应总体系为10 µL。其中，2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye）（北京全式金生物技术有限公司）5 µL，10 pmol/µL正、反向引物各1 µL，100 ng/µL DNA模板1 µL，ddHO 2 µL。PCR扩增程序为94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35次循环;最后72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。

1.2.3  电泳检测（银染法）  PCR产物扩增结束72 h内，取1 µL PCR产物上样于8%非变性聚丙烯酰胺凝膠单泳道，选用宝日医生物技术（北京）有限公司DL系列500 bp DNA Markers作为参照，1×TBE电泳缓冲液电泳分离。电泳结束后，参照任民等改良的NaOH银染方法快速显影。试验所用电泳仪器为DYY-12C型（北京市六一仪器厂），仪器运行参数为恒电压1200 V，电流200 mA，功率60 W，电泳1 h 50 min。

1.2.4  鲜烟叶表面分泌物提取及硅烷化处理方法  鲜烟叶表面分泌物提取及硅烷化处理方法参照屈亚芳等的方法进行。

1.2.5  GC-MS联用仪鉴定蔗糖酯的方法  GC-MS

联用仪参数：色谱柱是Rtx-5MS（30 m×0.25 µm×0.25

µm）;进样口温度265 ℃;离子源温度280 ℃;接口温度280 ℃;柱箱温度165 ℃;传输线温度280 ℃;升温程序：从165 ℃开始，以4 ℃/min升至280 ℃，保持25 min;进样量1 µL;分流比15：1;柱头压100 kPa;采集方式Scan;检索谱库：NIST8S。

本文蔗糖酯定性分析参照文献[18，23-24]中不同类型蔗糖酯的特征离子进行（表1）。

2  结  果

2.1  分子标记筛选

本试验选择与III-VI型糖酯共分离的PT20315、PT30209以及紧密连锁的PT30354、PT52061、PT61362 SSR分子标记作为候选引物，以含有I-II型糖酯的烤烟品种K326、红花大金元、小黄金1025，以及含有I-VI型糖酯（除含有I-II型糖酯外，还含有III-VI型糖酯，即BMVSE）的香料烟Samsun、雪茄烟Beinhart1000-1等5个种质作为引物初筛的供试材料，验证5个候选引物在不同类型蔗糖酯种质材料间是否具有多态性。试验结果如图2。由图2可知，分子标记PT20315、PT30354的引物在烤烟品种K326、红花大金元、小黄金1025三品种中

扩增出的DNA片段，通过电泳带型一致，在香料烟Samsun、雪茄烟Beinhart1000-1中扩增出的DNA片段，在两品种内电泳带型一致，但与3个烤烟品种的带型间具有明显的多态性，并且两个标记在不同种质间电泳带型清晰可辨，结果稳定，符合选择预期;分子标记PT30209、PT52061在不同种质间扩增结果虽然具有多态性，但PT30209存在扩增效果不稳定（部分种质无条带）、PT52061多态性结果与目标性状糖酯类型对应性较差的情况;PT61362电泳结果各种质间多态性不明显。研究结果初步表明，PT30209、PT52061、PT61362三个分子标记不宜作为III-VI型糖酯的辅助筛选标记利用，PT20315、PT30354两个标记可以作为III-VI型糖酯辅助筛选标记进一步验证利用。

2.2  PT20315和PT30354的群体验证

为进一步验证筛选的PT20315、PT30354两个标记的可用性，一方面，利用两个分子标记，对Beinhart1000-1和小黄金1025为亲本构建的192份RIL群体材料进行了基因型鉴定。将RIL群体中各材料的电泳带型分别与含多类型糖酯的Beinhart1000-1和不含多类型糖酯的小黄金1025的电泳带型比较，带型相同的材料表示基因型相同（图3）。由图3可见，筛选的PT20315、PT30354两个分子标记在RIL遗传群体中具有稳定、清晰的带型和多态性，能够准确鉴定区分群体中不同材料的基因型。

另一方面，提取RIL群体中各材料的鲜烟叶表面分泌物，利用GC-MS表型检测技术，鉴定了RIL群体各材料的糖酯表型，统计了群體中各材料基因型和糖酯表型的一致性（表2）。由表2可见，利用两个分子标记鉴定的群体材料的基因型，与利用GC-MS技术检测的群体材料的表型，其一致率均在90%以上，说明两个分子标记可以有效用于高糖酯烟草辅助育种中。

2.3  多态性分子标记辅助育种应用

当前，烤烟主栽品种中，糖酯类型较少，含量相对较低。为了加快多类型糖酯向烤烟主栽品种中的快速定向转移，以当前生产主栽品种K326、红花大金元等为定向改良对象，在分子标记辅助创建

的BC4、BC5代回交世代中，均已筛选到含有目标分子标记且综合性状优良的定向改良种质材料。入选的优良材料，经表型鉴定确认，已经导入多类型糖酯。其中，烤烟K326定向改良前、后糖酯表型检测结果如图4。由图4可知，改良前K326中仅检测到I、II型糖酯存在，而改良后K326中除检测到I、II型糖酯外，也检测到丰富的III、Ⅳ、V型糖酯存在。

利用分子标记辅助对主栽品种糖酯定向改良研究的有效性，进一步证明了研究筛选的两个分子标记在烟草育种中的可用性。同时，也证明，利用糖酯分子标记辅助选择，可以加快烟草糖酯定向改良的进程。

3  讨  论

糖酯是一类重要的植物表面化合物，在许多茄科植物如番茄、马铃薯、烟草、曼陀罗、矮牵牛等的腺毛分泌物中发现，而非茄科植物表面却很少发现。因其具有抗虫、抗菌、抗氧化等多种性能，目前，在番茄和马铃薯等茄科植物的育种工作中，提高糖酯含量已经成为一个重要育种目标。在烟草中，糖酯除具有以上生物功能外，还是烟草重要的致香前体物，也是当前卷烟加香加料的重要成分。随着中式卷烟的发展和新型烟草制品的开发，卷烟工业越来越需求香气质好、香气量足、香气风格特色突出的高端卷烟原料。经定向改良的高糖酯红花大金元品种的烟叶样品，感官评价各项主要指标均优于对照红花大金元，进一步说明糖酯对烟叶香气品质的重要贡献。因此，提高烟叶糖酯含量，特别是培育高糖酯含量的烟草品种，已经受到烟草工农业科技工作者的重视。

烤烟主栽品种中一般不含BMVSE，糖酯类型较少、含量较低，为加快高糖酯含量品种筛选和培育工作，本研究对VONTIMITTA等定位获得的与BMVSE基因连锁的5个SSR标记，利用不同遗传背景种质，进一步开展了筛选验证研究。研究结果表明，PT20315、PT30354两个分子标记在不同遗传背景中多态性稳定，并且电泳条带清晰，利用两个分子标记辅助高糖酯表型筛选，准确率达到90%以上，可以有效用于高糖酯烟草分子辅助育种中。在这两个分子标记辅助育种应用过程中我们也发现，虽然文献[17]报道PT20315与糖酯目标性状表现共分离，PT30354与目标性状连锁距离稍远，但在本研究的有些分离群体中，PT20315分子标记比PT30354更易打破与目标性状的连锁，说明不同遗传背景中，分子标记所在染色体位点的重组率可能有所不同。分子标记PT30209在不同种质间存在扩增效果稍差、部分种质无条带，PT52061多态性结果与目标性状糖酯类型对应性较差，PT61362电泳结果各种质间多态性不明显等情况。原因可能是本研究所用种质与VONTIMITTA等所用种质遗传背景不同，经长期进化或育种选择驯化，这些分子标记在不同遗传背景中对应位点的序列可能有差异所致。

本研究中筛到的两个可用标记，虽然准确率达到90%以上，但仍然存在少部分植株虽含有分子标记，但却不含目标性状的情况。原因可能是分子标记受环境和遗传背景等因素影响，导致分子标记所检测材料的基因型结果与糖酯表型存在差异。所以，在实际的育种工作中，在杂交、回交早期分离世代，可以利用分子标记辅助选择，对高世代入选的目标株系，还需结合表型鉴定进一步确认。根据遗传研究结果，栽培烟草BMVSE糖酯类型受单基因调控，所以，深入发掘糖酯类型差异调控基因并开发其功能分子标记，是进一步提高糖酯分子辅助育种准确性的重要途径。此外，遗传研究表明，

BMVSE调控基因与烟草表面重要致香前体物顺-冷杉醇的调控基因紧密连锁，并且已有研究表明，顺-冷杉醇也是特香型烤烟（如大白筋599，革新三号等）的重要致香物质基础。因此，利用本文筛选的分子标记辅助糖酯筛选的同时，也将提高糖酯和顺-冷杉醇同时筛选的可能性。这将对利用分子标记加快特色高香气品种的培育工作具有重要意义。

4  结  论

PT20315等5个糖酯连锁SSR分子标记在不同遗传背景的烟草种质的筛选和验证结果表明，PT20315、PT30354两个分子标记在不同遗传背景中多态性稳定，电泳条带清晰，并且其多态性条带与糖酯表型差异的对应性较好。在重组自交系群体中，两个分子标记辅助高糖酯表型筛选的准确率均达到90%以上，可以有效用于高糖酯烟草分子辅助育种中。分子标记PT30209在不同种质间扩增效果稍差、PT52061多态性结果与糖酯表型对应性较差、PT61362在各种质间多态性不明显，这3个标记不宜在糖酯分子标记辅助育种中利用。利用PT20315、PT30354两个分子标记辅助选择，已获得定向改良高糖酯K326新品系。

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