枸骨IcFPS1基因的克隆、表达及生物信息学分析

马良琼 曾慧 罗彩霞 张威威 许锋 程水源

摘要：法尼基焦磷酸合酶（farnesyldiphosphatesynthase，FPS）是三萜皂苷生物合途径的一个关键酶，为研究FPS基因在枸骨中的功能，该研究采用PCR技术将一个FPS基因的cDNA序列从枸骨叶中分离出来，并命名为IcFPS1。结果表明：根据测序结果分析发现扩增获得的IcFPS1基因cDNA长度为1591bp，包含一个完整的开放阅读框，大小為1029bp。通过序列分析发现枸骨IcFPS1基因编码342个氨基酸，分子量和等电点分别为39.58kDa和5.18。通过理化性质预测分析发现IcFPS1蛋白不含信号肽，不含有跨膜区域，该IcFPS1蛋白为亲水性蛋白质。通过序列多重比对发现IcFPS1蛋白质与其他植物的FPS蛋白质高度同源，有共同的保守区域和氨基酸序列，其中与西洋参FPS序列的相似性高达89%。通过系统进化树分析发现枸骨FPS蛋白与同属于被子植物的五加科植物FPS蛋白亲缘关系较近，说明FPS基因在进化过程中相对比较保守。根据蛋白调控网络预测分析结果发现该蛋白可能与IPP1、IPP2、GGPS3、GGPS6和ERA1相互作用，参与类异戊二烯的合成代谢过程。通过实时荧光定量PCR分析发现IcFPS1基因在枸骨各个组织部位中均有表达，其中在枸骨根中表达量最高，在茎和雌花中表达量最低。

关键词：枸骨，法尼基焦磷酸合酶，三萜皂苷，克隆，表达

中图分类号：Q943

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2019）03-0328-08

枸骨（Ilexcornuta）为冬青科灌木或乔木，四季常青，可用于绿化。同时，枸骨在传统上也是常用中药之一，枸骨根、叶、果实等组织均可入药，在常见病痛治疗方面有较好疗效（彭国全等，2011）。根据《本草拾遗》记载，枸骨叶具备清热养阴、补肝益肾、祛风湿等功效，在肺痨咳嗽、劳伤失血等疾病治疗方面也有很好的应用（左文健等，2011）。枸骨叶中含有许多次生代谢物质，包括三萜及其皂苷、黄酮及其多酚类化合物（李国文等，2011）。因此枸骨具有重要的商业和药用价值。

枸骨叶中主要成分之一的三萜皂苷是广泛分布于人参、灵芝、三七、墨旱莲等药用植物中的一类重要次生代谢产物，属于中药植物的主要活性成分之一，具有抗癌、抗氧化、消炎解毒等功效（张召宝等，2015）。整个三萜生物合成过程涉及法尼基焦磷酸合酶、鲨烯合酶、鲨烯环氧酶或单加氧化酶、氧化鲨烯环化酶等一系列酶的催化。法尼基焦磷酸合酶（farnesyldiphosphatesynthase，FPS）是一种异戊烯基转移酶，它催化五碳原子的二甲丙烯基焦磷酸和异戊烯基焦磷酸以头尾连续缩合反应，进而形成碳原子的法尼基焦磷酸，成为植物体内皂苷、倍半萜、甾体、橡胶等许多萜类衍生物质的合成前体（Cunilleraetal.，1996）。至今，在洋甘菊（杨秀梅，2013）、拟南芥（Cunilleraetal.，1996）、刺五加（周秘等，2013）、绞股蓝（蒋东等，2014）、三七（陈莉等，2006）等许多植物中已经进行了FPS基因的分离和功能研究，研究结果证实FPS是植物三萜皂苷生物合成途径的一个关键酶，能够调控植物类异戊二烯途径，促进三萜皂苷的合成。截至目前，在枸骨上尚且没有发现FPS基因的研究报道，克隆FPS基因并进行功能研究是揭示FPS基因在枸骨三萜生物合成途径中功能的前提。在本项目中，我们对枸骨FPS基因进行了克隆、对其序列进行了生物信息学分析、并进行了组织表达分析。研究结果可为弄清FPS基因在枸骨三萜类生物合成中的调节作用奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

本研究中的枸骨材料采摘于长江大学校园，收集五种不同的组织（根、茎、叶、雄花、雌花）用于RNA提取和基因表达分析，采摘的材料立即在液态氮中速冻并储存在-80℃超低温冰箱中待用。

1.2方法

1.2.1RNA的提取和cDNA合成将枸骨的不同器官（根、茎、叶、雄花、雌花）在液氮中磨成细粉末状，参照PlantRNAExtractionKit（TaKaRa，MiniBEST）试剂盒说明书提取各组织总的RNA。分光光度计和琼脂凝胶电泳检测质量较好的RNA用于cDNA的合成。枸骨cDNA的合成以RNA为模板，采用PrimeScriptTM的cDNA反转录试剂盒（TaKaRa，Dalian，China）完成。

1.2.2枸骨IcFPS1基因的克隆根据枸骨的转录组测序数据设计并合成FPS基因扩增特异引物，上游引物为IcFPSF1：5′-ATTAAGACCATCTGTGGAGCCTAGC-3′，下游引物为IcFPSR1：5′-GGGTGACAGGTTTGTATAGCATCCA-3′。PCR反应体系25μL，包括ddH2O16.5μL，10×Buffer2.5μL，MgCl22.0μL，dNTP0.5μL，上下游引物各1μL，cDNA模板1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL。PCR反应条件：94℃预变性4min;94℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸90s，共32个循环;最后72℃延伸10min，4℃结束。PCR扩增结果用1%的凝胶电泳检测，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化扩增产物，纯化产物连接到从宝生物购买的pMD19-T载体上，并转化到DH5α感受态细胞中。转化后的感受态细胞经活化苏醒后被均匀地涂抹于含有Amp的LB的培养皿中，挑取菌落进菌液活化，并进行菌液PCR扩增验证，阳性结果菌液送往上海生物工程公司进行测序。

1.2.3生物信息学分析IcFPS基因cDNA序列和蛋白质序列比对利用在线工具NCBI-blast（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BlAST/）完成。运用VectorNTISuitev11.5和DNAMAN8来分析IcFPS1基因的cDNA序列，进行蛋白质翻译。IcFPS1蛋白质理化学性质的分析采用工具ProtParamtool（http：//web.expasy.org/protparam/）进行。信号肽预测、疏水性分析、跨膜区域预测分别用在线工具SignalP4.1Server、ProtScale和TMHMMServerv.2.0完成。蛋白质二级结构分析借助SOPMA工具实现。利用软件AlignX（VectorNTISuiteV11.5）对多种植物的FPS蛋白进行多重比对分析，利用ClustalX2.0和MEGA6.0软件采用邻接（NJ）方法构建FPS基因系统进化树，使用Bootstrap对系统树可信性进行检验，重复1000次。应用STRING交互式数据库（https：//string-db.org/）构建候选蛋白与相关蛋白的相互作用网络，分析预测IcFPS1蛋白在互作网络中的作用关系，保留可信度大于0.700相互作用关系，用Cytoscape3.61调整展示互作网络图。

1.2.4实时荧光定量PCR分析使用RNA提取试剂盒（PlantRNAExtractionKit）从五种不同的组织器官样品中提取总RNA。根据IcFPS1基因的cDNA序列设计实时荧光定量引物，上游引物为IcFPSRT-S：5′-ACAGATTACCGAAGGTTGGTATG-3′，下游引物为IcFPSRT-A：5′-GGTTGTCTGGAATTCTACCTCATTA-3′。qRT-PCR内参基因选用的是IcGAPDH，上游引物序列IcGAPDH-S：5′-TATCAACGGCTTCGGTCGCA-3′，下游引物序列IcGAPDH-A：5′-GGACGGAGTCGTACTTGAGCAT-3′。引物送往上海生工生物技术有限公司合成。实时荧光定量PCR在杭州博日科技有限公司的Linegene9600PCR仪上进行，反转录和荧光定量PCR的操作依照试剂盒PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser和SYBRRPremixExTaqTMII的操作步骤说明书逐步进行。反应程序为95℃、30s，95℃、5s;60℃、30s，共40个循环。每种样品三次取样重复，三次技术重复，并分别设置一个阴性对照（模板为ddH2O）。IcFPS1基因的相对表达水平计算通过使用2-ΔΔCt法完成（Livak&Schmittgen，2001）。

2结果与分析

2.1IcFPS1基因cDNA克隆与序列分析

利用特异性引物，以反转录cDNA为模板，通过PCR技术从枸骨中克隆得到一条FPS基因序列，通过NCBI网站的在线程序Blast比对分析显示该cDNA序列与其他物种的FPS基因序列具有较高的相一致性，克隆获得的cDNA序列为枸骨的FPS基因，命名为IcFPS1。此cDNA序列长度为1591bp，包含1029bp的开放阅读框，编码342个氨基酸（图1）。

2.2枸骨IcFPS1蛋白质理化性质和结构分析

IcFPS1蛋白质含有342个氨基酸。在线网站分析表明，IcFPS1蛋白质的分子量和等电点分别为39.58kDa和5.18。蛋白质不稳定系数为33.87，该蛋白质为稳定蛋白。SignalP4.1Server信号肽预测结果发现IcFPS1蛋白不含有信号肽，蛋白质疏水性分析显示IcFPS1为亲水蛋白。蛋白质跨膜区域分析结果表明，IcFPS1蛋白不含有跨膜区域。通过SOPMA工具分析该蛋白质二级结构，分析结果表明IcFPS1蛋白主要由α螺旋、无规则卷曲、延伸链和β转角结构组成，其所占比例分别为65.5%、24.56%、6.73%和3.22%。同源比对分析通过在线工具BlASTP（NCBI）和AlignX（VetctorNTI11.5）完成。用NCBI的ConservedDomainSearch工具分析蛋白質保守域，结果显示IcFPS1蛋白质属于Isoprenoid_Biosyn_C1超级家族的成员，含有Polyprenylsynthetase保守区域（图2下划线区域），表明IcFPS1参与类异戊二烯的生物合成。

2.3枸骨IcFPS1蛋白质的同源比对

同源比对发现，该蛋白质与其他植物的FPS蛋白质相似性较高（图2）。其中枸骨IcFPS1蛋白质和西洋参（ADJ68004）、人参（AAY87903）、常春藤（APV45530）、龙牙楤木（ADK12004）、积雪草（AAV58896）、白桦（AKQ62666）、野茶树（ANA11766）、刺五加（AEY77151）和缬草（AIU63880）的FPS蛋白质之间的相似性比分别为89%、88%、87%、87%、87%、87%、87%、87%和86%。不同物种之间FPS蛋白有较高的一致性，暗示在功能上可能也是相同或相似的。

2.4IcFPS1蛋白质的系统分析

系统进化树采用ClustaIX2.0和MEGA6.0软件构建的，目的是进一步探索FPS蛋白质在不同物种之间的进化关系。如图3所示，所有的FPS蛋白都来自于一个共同的祖先，不同物种的FPS蛋白质也被清晰地归类到三个分支，分别为植物、动物和真菌（图3）。系统进化树分析显示枸骨FPS1蛋白与被子植物界双子叶植物五加科的FPS蛋白亲缘关系最近，聚类在同一分支上;而蔷薇科的玫瑰、梅、白梨的FPS蛋白聚类到另一分支上。该结果表明，FPS1蛋白可能与五加科的FPS蛋白质在功能上更为接近。枸骨IcFPS1在功能上也可能与五加科植物的FPS蛋白相同，参与调控三萜皂苷的合成代谢。

2.5枸骨IcFPS1蛋白质互作网络分析

利用STRING蛋白互作数据库对枸骨IcFPS1蛋白进行相互作用分析，物种参数选择模式植物拟南芥，构建了的蛋白互作网络（图4）。IcFPS1蛋白可以与10个蛋白互作，其中IPP1、IPP2、GGPS3、GGPS6和ERA1都是植物类异戊二烯合成途径的调节酶，该互作网络表明枸骨IcFPS1蛋白可能与这些蛋白存在一些相似的功能，或共同参与植物类异戊二烯的合成代谢过程。

2.6IcFPS1的组织表达分析

为了研究IcFPS1基因的各个组织器官的表达水平，提取枸骨的根、茎、叶、雄花、雌花的总RNA，使用反转录试剂盒获得cDNA，利用qRT-PCR技术测定枸骨各组织器官中IcFPS1基因的表达水平。qRT-PCR分析结果发现，IcFPS1基因在各个组织器官中都有表达。其中在枸骨根中的基因表达量最高，叶中表达量次之，雄花中较低，在茎和雌花中的表达量最低（图5）。枸骨的主要药用部位是根和叶片，本研究中IcFPS基因也在这两个部位中表达量较高。因此，推测IcFPS基因可能参与了枸骨三萜类物质的生物合成调控，是枸骨三萜皂苷合成代谢中的一个关键酶基因。

3讨论与结论

FPS参与类异戊二烯生物合成途径，属于植物次生代谢三萜皂苷与甾醇合成途径中的一个限速酶，也是三萜皂苷合成生物学研究的其中一个重要酶。本研究克隆得到枸骨的IcFPS1基因，对其进行了生物信息学分析和功能预测。结果表明，IcFPS1蛋白质属于Isoprenoid_Biosyn_C1超级家族，与其他植物尤其是药用植物的FPS蛋白质具有较高的相似性，与五加科的FPS蛋白亲缘关系较近，结合蛋白质互作网络分析，证实枸骨IcFPS1参与类异戊二烯代谢途径，可能参与调控枸骨三萜皂苷的生物合成。

qRT-PCR分析结果表明IcFPS1基因在枸骨各个器官组织中的表达量具有部位差异性，其中在根中的基因表达量最高，其次是叶，在茎和雌花中表达量最少，这种现象或许与FPS在三萜皂苷代谢途径中的功能有关。目前已在许多植物上进行了FPS基因的分离和功能验证。Cunilleraetal.（1996）克隆了拟南芥FPS基因，qRT-PCR分析结果表明拟南芥FPS1和FPS2基因在幼苗的根、茎、叶和花中都有表达;其中，FPS1基因在根和花中最高表达，FPS2基因表达水平较低，具有组织表达差异性，这与我们的研究结果相似。在白木香FPS基因功能研究中，组织表达结果表明FPS基因的表达量最高是根，其次是茎，表达量最少的是叶，推测该基因在根和茎两个组织中发挥生物学功能，与白木香的形成部位相关（杨欣等，2013）;在人参中，FPS基因表达分析结果表明该基因在叶的表达量最多（杨林林等，2017），这与本文研究中根的表达量最多不同。在三七FPS基因的功能研究时发现，在三七细胞中过表达FPS基因可以促进三七总皂苷积累（杨延等，2015）。周秘等（2013）对刺五加法尼基焦硫酸合酶研究发现，PFS基因刺五加整个发育时期的表达量与其皂苷含量呈现基本相似的变化趋势，证实FPS是刺五加三萜皂苷生物合成的一个关键酶。这些结果表明FPS基因的表达与三萜化合物的生物合成密切相关。因此可以推断，枸骨的IcFPS1基因也可能参与了枸骨三萜类物质的生物合成。

总之，本研究克隆获得了枸骨的IcFPS1基因，对其核酸序列和蛋白质进行了生物信息学分析预测，构建了枸骨IcFPS1蛋白质互作网络;并分析了IcFPS1基因在枸骨不同组织部位中的表达水平，该研究为进一步弄清IcFPS1基因在枸骨三萜皂苷生物合成中的作用奠定了基础，为提高枸骨三萜皂苷含量提供了一定的理论依据。

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