UPLC/MS/MS法定性定量测定中药材中3类27种合成色素

张甦　胡青　孙健　冯睿　于泓　季申

摘要 目的：采用液相-固相萃取-超高效液相色谱-电喷雾串联质谱联用技术对27种色素建立了准确、灵敏的分析方法。方法：针对脂溶性、酸性和碱性3类色素分别采用不同的制备方法、色谱条件和电喷雾极性，采用4种不同药用部位的代表性药材进行了方法学考察。结果：表明方法线性关系良好（r≥0.997）;脂溶性和碱性色素的检测限为0.03～3.87 ng/g，酸性色素为0.003～1.94 μg/g;准确度和精密度分别为70%～105%和0.9%～6.8%;应用于25个品种80批样品的筛查。结论：所建方法可靠、高效、准确，适用于中药材复杂基质中不同种类色素的测定。

关键词 27种;合成色素;脂溶性;酸性;碱性;定性定量;中药材;UPLC/MS/MS

Qualitative and Quantitative Determination of 27 Synthetic Dyes of 3 Species in Herbs by UPLC/MS/MS

Zhang Su1，2，Hu Qing1，Sun Jian1，Feng Rui1，Yu Hong1，Ji Shen1

（Shanghai Institute for Food and Drug Control，Shanghai 201203，China）

Abstract Objective：To develop a sensitive and accurate method combining liquid and solid phase extraction with ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry to analyze 27 dyes.Methods：Different preparations，chromatography conditions and polarity of ESI were applied for 3 categories of lipophilic，acidic and basic dyes respectively.Four species of herbs representing different parts of plant were selected for methodology observation.Results：The linear correlation coefficient was good（r ≥ 0.997）.The LODs of oil soluble and basic dyes were 0.03～3.87 ng/g and acid dyes were 0.003～1.94 μg/g respectively.The accuracies and precisions were 70%～105% and 0.9%～6.8% respectively.Conclusion：After detecting 80 samples of 25 species herbs，this method proved to be reliable，efficient and accurate in the detection of different kinds of dyes in the complex matrix of herbs.

Key Words 27 kinds; Artificial dyes; Lipophilic，Acidity; Basicity; Qualitative and quantitative determination; Herbs; UPLC/MS/MS

中圖分类号：R284.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.04.007

中药主要为天然产物，随着社会发展，人们对身体健康愈加重视，市场对中药的需求不断增加，价格也水涨船高。由于当前中药生产、经营秩序尚未完全规范，社会诚信体系缺失，监管无法涉及所有环节，中药染色、以劣充好等违法违规行为仍屡禁不止[1-3]。这些违法行为严重危害人民身体健康和生命安全、影响中医中药的声誉和中医药事业的健康发展。特别是合成色素的添加，其特征的偶氮基团（-N=N-）结构，易被肠道菌群还原形成芳香胺类化合物[4]，可引起神经毒性[5]、基因毒性[6]以及致癌性[7]。

目前，合成色素的分析方法包括薄层色谱法（TLC）[8]、毛细管电泳法（CE）[9]、离子色谱法[10]、高效液相色谱法（HPLC）[11-12]、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[13-14]、液相色谱-四极杆飞行时间质谱法[15-16]等。本实验室已建立了快速检测的薄层色谱法，粗略定量和定性的高效液相色谱法[17]以及用于定性的UHPLC-Q-TOF法[18]。这些方法可在不同水平的实验室用于不同处理过程的色素测定。本文重点阐述利用UPLC/MS/MS对色素同时进行定量和定性分析。对3组色素的流动相和质谱条件进行优化，为体现不同基质的复杂性，选用4种不同药用部位的代表性药材进行了方法学考察。应用该方法对25个品种80批样品进行了测定，结果表明该方法灵敏、准确，适用于中药材基质中染色色素的测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器 采用超高效液相色谱-串联质谱联用技术（UPLC/MS/MS），在正、负离子2种采集模式下，对复杂中药基质中的目标化合物进行了鉴定。Waters ACQUITY UPLC I-Class（Milford，Massachusetts，USA）由二元泵（BSM）、进样器（SM-FTN）和柱温箱（CM-A）组成，配有AB Sciex API 4000 MS/MS系统（Framingham，Massachusetts，USA），采用Analyst 1.6.1软件进行数据采集和处理。

1.2 试剂 根据溶解性和酸碱性将色素对照试剂分为3组。见表2。对照试剂的生产厂家包括Sigma-Aldrich（St.Louis，MO，USA），Dr.Ehrenstorfer GmbH（Augsburg，German），Fluca（Buchs，Switzerland）and和NIFDC（中国国家食品药品监督管理局，北京）。在标签或分析证书上显示对照试剂纯度均超过80%。提取用甲酸、氨水、乙腈、甲醇为分析级试剂，购自国药控股化学试剂有限公司（上海）。质谱流动相包括甲酸铵，甲酸和乙腈是LC/MS级，购自默克公司（KGaA，Darmstadt，Germany）。

1.3 分析样品 选取了25种不同颜色的中药材作为样本，包括花、茎、根和果实等植物的典型部位。均为市售，包括山茱萸，黄连，丹参，槐米，大黄，制何首乌，乌梅，酸枣仁，醋延胡索，关黄柏，鸡血藤，片姜黄，黄芩，茜草，蘇木，五味子，生蒲黄，红花，番泻叶，枸杞子，花椒，青黛，人工牛黄，松花粉，月季花，南五味子。上述前4种中药材分别作为果实、根、茎、花的代表进行方法学验证。以上均由上海华宇中药材材有限公司（中国上海）提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱采用Poroshell 120 EC-C18 column（3.0 mm×100 mm，2.7 μm，Agilent，Palo Alto，CA，USA）。柱温：40 ℃。正离子扫描模式下，流动相为0.1%甲酸/20 mmol/L乙酸铵溶液（A）-乙腈（B）;负离子扫描模式下，流动相为2 mmol/L乙酸铵溶液（A）溶液-乙腈（B），梯度洗脱程序见表1。流速：0.4 mL/min，进样体积：1 μL。

2.2 质谱条件 采用MRM监测脂溶性色素和水溶性碱性色素洗脱液电离后的阳离子，水溶性酸性色素的电离后产生的阴离子。Q1和Q3质量分析器的质量选择以单位分辨率为基准。设定一个子离子用于定量，另一个用于定性。采用氮气作为离子源气体1、离子源气体2、气帘气、碰撞气，流速分别控制在65、60、30、6 psi。电喷雾电压正离子模式为5 500 V，负离子模式为-4 500 V。离子源温度：600 ℃。利用27种色素的对照试剂溶液采用流注分析法（FIA）分别对去簇电压（DP）、碰撞能量（CE）和代表性子离子进行优化，其优化值见表2。

2.3 供试品溶液

根据色素的基本结构，对不同色素采用不同的提取和制备方法，以确保色素的纯化效率。

脂溶性色素：取药材粗粉1 g，加乙腈25 mL，超声处理30 min，离心，取上清液作为供试品溶液。

水溶性碱性色素：取药材粗粉1 g，加0.1%甲酸甲醇溶液25 mL，超声处理30 min，离心，取上清液5 mL，快速通过聚酰胺小柱（1 g，内径为1 cm，依次用甲醇3 mL和0.1%甲酸溶液3 mL预洗），流速约每分钟5 mL/min，用60%（v/v）甲醇/水溶液（含0.1%甲酸）5.0 mL以低于5.0 mL/min的流速洗脱。洗脱液离心并用0.22 μm滤膜过滤，作为供试品溶液。

水溶性酸性色素：除提取液（60%（v/v）甲醇/0.1%甲酸）为溶剂外，处理过程与碱性色素提取相同。洗脱溶液更改为8 mL甲醇-氨水-水（v/v，7∶2∶1）。洗脱液加入2 mL的25%甲酸溶液震摇，离心过滤通过0.22 μm滤膜过滤，作为供试品溶液。

2.4 对照试剂溶液

合成色素分成3组（O，B和A），配制浓度约为500 μg/mL的对照试剂储备液。脂溶性组用乙腈溶解，其他2个水溶性组分别用水溶解。储备液均保存于-4 ℃，根据需要稀释至不同浓度。

2.5 色素的选择和分组

食品中允许适当使用色素，因此色素的限制重点在禁用的种类和过量使用。但中药材中的色素情况却不同。滥用色素的目的是冒充正品或以次充好，导致中药材伪品质量差，影响药效，甚至对人体有害。因此中药材中不允许添加色素。

本研究主要针对合成色素，包括报告公布的中药材中已检出色素（金胺O，亮蓝等），在食品基质中报道过的禁用色素（苏丹系列和罗丹明B等），以及在食品中应用的普通色素（苋菜红，柠檬黄等）。选取了覆盖不同色系和不同性质色素，以扩大方法的适用范围。由于所选色素性质不同，我们将其分为脂溶性、水溶性碱性和水溶性酸性3类。为了最大限度地提高提取和纯化效率，对3组色素采用不同的前处理方案。

2.6 色素的提取

由于色素的溶解性和酸碱性存在差异，因此选用不同的溶剂提取色素。对脂溶性色素通过比较环己烷和乙腈的影响，最终选择乙腈作为提取溶剂。对于水溶性色素，含0.1%甲酸的甲醇溶液有助于提取。对于酸性色素，考察了不同比例的甲醇-0.1%甲酸溶液。最终，60%（v/v）甲醇/水溶液（含0.1%甲酸）效果最好。具体内容已在我们之前的研究中有所讨论[17-18]。

作为中药材的草本植物通常是干燥的，这与食品基质有很大不同。一旦药材被染色，带有静电荷的分子会强烈吸附在药材纤维上，使得提取非常困难。为了最大限度地提取色素而非提取中药材中的成分，与振摇、索氏提取和加热回流进行比较后，选择超声处理方式。

2.7 色素的纯化

由于中药材中色素检测方法报道很少，参考食品中色素的不同纯化方法。在多数情况下，制备方法会根据目标色素的性质进行调整，如氧化铝、大孔树脂、HLB[14]、聚酰胺[11]、离子交换SPE[15，20-21]。其中，由于酰胺基与色素的偶氮结构之间存在氢键相互作用，聚酰胺对碱性色素和酸性色素的净化均有良好的作用。

本文采用商品化的聚酰胺固相萃取小柱，简化操作步骤，提高结果重复性。对碱性色素和酸性色素洗脱液pH值进行考察。通过对填料规格、洗脱溶液比例和洗脱溶剂体积进行优化，最终测定条件如2.3所述。

2.8 流动相优化

由于脂溶性色素中偶氮键的存在以及碱性色素中季铵盐的存在，含0.1%甲酸的流动相可增强正离子的响应，同时加入乙酸铵后峰形得到改善。流动相不仅在分离方面表现良好，而且对这些化合物的响应也表现良好。但酸性色素不是这样。由于酸性色素含有硫酸根，缓冲盐浓度越高，对峰响应的抑制作用越大。当乙酸铵浓度降低到2 mmol/L时，响应增加了约50倍，并且对分离效果和峰形没有干扰。见图1。

2.9 母离子和子离子的选择

所有质谱参数均利用色素对照试剂溶液流注法进行优化。我们选择一个响应强的子离子作为MRM模式的定量离子，另一个作为定性离子。但对于某些酸性色素（亮蓝色和亮黄色），由于含有对称结构和硫酸根导致[M-H]2-稳定存在，而不是[M-H]-。所以我们选择[M-H]2-作为母离子，及其子离子作为配对离子。

2.10 方法验证

以丹参、山茱萸、槐米、黄连分别代表的果、根、茎、花不同药用部位进行方法学研究。

2.10.1 线性关系

线性关系中脂溶性和碱性色素对照试剂浓度分别为0.05、0.1、1、10、50 ng/mL，酸性色素浓度分别为0.005、0.01、0.1、1和5 μg/mL。以各色素的峰面积对浓度进行线性回归，并通过计算相关系数，对线性回归方程进行评价。各相关系数均大于0.997，说明该方法线性关系良好。结果见表3。

2.10.2 检测限

分别在4个样品中加入线性标准中最低浓度的对照试剂溶液测定检测限。以各色素3倍的信噪比（S/N）作为检测限（LOD），脂溶性和碱性色素检测限范围分别为0.03～3.87 ng/g和0.003～1.94 μg/g。由此明显可以看出负模式的响应比正模式低10～100倍。结果见表3。

2.10.3 稳定性

通过对同一批山茱萸样品在24 h内每隔4 h测定一次，进行稳定性分析。采用相对标准偏差（%RSD）作为稳定性指标。不同时间色素的峰面积经比较差异较小，在1.2%～4.9%之间，说明样品在测定条件下是稳定的。见表3。

2.10.4 准确度和精密度

通过测定加入4种药材中的对照试剂含量考察方法准确度。添加3个浓度水平的对照试剂计算平均回收率。结果表明分析方法准确度较好，回收率在70.0%～105%之间（表4）。日落黄和羊毛绿结果均不佳，尤其是在槐花中。按照该方法对同一样品重复进样6次验证方法精密度。

2.11 应用

从市场中随机购买25个品种80批中药材。其中，11个样品中检出非法添加色素，检出率高达13.8%。金胺O是一种高频检出色素，常见于大黄、大黄、红花等黄色和红色中药材。金橙II和酸性红18或73是另外2種常用色素，常见于丹参、红花等红色中药材。在一批红花样品中同时检出了4种色素。亮蓝FCF和G是在制何首乌、乌梅等黑色中药材中首次报道发现的色素。根据表5所示的结果，中药材中染色色素应引起更多关注。

3 总结

通过聚酰胺固相萃取柱纯化和UPLC-MS/MS相结合建立了中药材中的27种色素准确、灵敏的筛查方法。本方法结果可靠，重现性好，检测限符合要求，分析时间短，可用于颜料类的常规分析。与食品基质不同的，中药材自身干燥，成分复杂，给方法的建立造成一定困难。本方法首次应用于中药材中的非法添加色素，结果应引起更广泛的重视。未来的研究将报道进一步改进后的制备方法和检测技术。

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