基于超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱技术的黄芪注射液中化学成分分析

于泓　胡青　孙健　冯睿　张甦　张静娴　毛秀红　季申

摘要 目的：基于超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（Ultra-performance Liquid Chromatography Quadrupole Time-of-flight Mass Spectrometry，UPLC/Q-TOF-MS）对黄芪注射液物质基础进行了全面的研究，建立及黄芪注射液中有关成分的快速准确的分析方法。方法：采用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱（3 mm×100 mm，1.8 μm），以含0.1%甲酸水溶液-乙腈为流动相，梯度洗脱，流速0.4 mL/min;电喷雾源（ESI），Q-TOF-MS作检测器，正、负离子模式检测;甲醇稀释样品;与对照品保留时间、母离子及碎片离子精确分子量，比对准确定性。结果：共鉴定黄芪注射液中的46个化合物，包括氨基酸，黄酮，皂苷，核苷和烟酸等。结论：建立了黄芪注射液中的复杂化学成分的快速检测和评价方法，为其的质量控制及工艺改进提供参考。

关键词 黄芪注射液;黄芪;化学成分;Q-TOF-MS;皂苷;黄酮;氨基酸;核苷

Comprehensive Screening of Multi-components in Huangqi Injection by Ultra-performance Liquid Chromatography Coupled with Quadrupole-time-of-flight Mass Spectrometry

Yu Hong，Hu Qing，Sun Jian，Feng Rui，Zhang Su，Zhang Jingxian，Mao Xiuhong，Ji Shen

（Shanghai Institute for Food and Drug Control，Shanghai 201203，China）

Abstract Objective：To study comprehensive screening multi-components in Radix Astragali and Huangqi injection，based on high-resolution quadrupole-time-of-flight mass spectrometry.Methods：The analysis was performed by Agilent Eclipse Plus C18 column（3 mm × 100 mm，1.8 μm）with the mixture of 0.1% formic acid aqueous solution-acetonitrile as mobile phase by gradient elution，and the flow rate was 0.4 mL/min.Q-TOF-MS equipped with ESI ion source was performed in both positive and negative ionization.Samples were diluted with methanol.Qualitative analyze was based on retention time，the accurate mass of the precursor ion and product ions.Results：A total of 46 components including amino acids，flavonoids，saponins，nucleosides and nicotinic acid were successfully identified or tentatively characterized.Conclusion：This study is expected to provide an effective pattern for systematic characterization of the complex Huangqi injection systems，and establish a reliable strategy for its quality evaluation，also offers a reference for quality control as well as technological improvement.

Key Words Huangqi injection; Radix Astragali; Components; Quadrupole-time-of-flight mass spectrometry; Saponins; Flavonoids; Amino acids; Nucleosides

中圖分类号：R284.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.04.005

黄芪注射液是我国较早开发的中药注射液品种之一，是豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪干燥根的水提灭菌溶液，具有广泛的药理作用。皂苷类、黄酮类、氨基酸类成分为其功效的主要物质基础[1]。具有益气养元，扶正祛邪，养心通脉，健脾利湿的功效。广泛应用于心气虚损，血脉瘀阻之病毒性心肌炎[2]，心脑血管疾病[3-4]及肾脏疾病[5]等。急性毒性试验、长期毒性试验[6]以及临床研究均表明：黄芪注射液效果确切，不良反应较少[7]，是具有研究和开发价值的中药注射剂品种[8]。为了提高黄芪注射液的质量，降低不良反应发生概率，亟待对其化学成分进行深入研究。

成分的复杂和缺乏对照品，是中药及天然产物分析的共同难题。液相色谱串联高分辨率质谱（UPLC/Q-TOF-MS），且具有较高的选择性和灵敏度，近年来也常被用于中药和天然药物的成分分析[9-12]。可实现非目标的成分分析模式[13-14]，利于未知化合物的发现和鉴定。

本研究采用超高效液相串联四级杆飞行时间质谱，根据精确分子量和碎片离子信息，并结合相关文献数据[15]，鉴定了46种化合物，其中24种已通过对照品确证。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1290 Infinity高效液相色谱仪，Agilent 6550 Q-TOF质谱仪（美国Agilent公司），Sartorius MSU225P-1CE-DU分析天平（德国Sartorius公司），超声仪（上海科导超声仪器有限公司）。甲醇、盐酸和乙酸乙酯为分析纯试剂（上海凌峰化学试剂有限公司）;质谱用水和乙腈为LC-MS级试剂（德国Merck公司），甲酸为色谱纯试剂（德国Merck公司）;质谱所用参比液，调谐液均为美国Agilent公司提供。

1.2 试剂

标准对照品：苏氨酸（Threonine，A2），谷氨酸（Glutamic acid，A3），脯氨酸（Proline，A4），缬氨酸（Valine，A5），L-异亮氨酸（L-isoleucine，A6），酪氨酸（Tyrosine，A7），L-亮氨酸（L-Leucine，A8），苯丙氨酸（Phenylalanine，A8），胸腺嘧啶脱氧核苷（Thymidine，A9），色氨酸（Tryptophan，A10），烟酸（Nicotinic acid，O1），尿苷（Uridine，O2），腺苷（Adenosine，O3），毛蕊异黄酮-7-葡糖苷（Calycosin-7-glucoside，F4），染料木苷（Genistin，F6），芒柄花苷（Ononin，F9），毛蕊异黄酮（Calycosin，F12），芒柄花素（Formononetin，F14），黄芪甲苷（Astragaloside IV，S6）均购于中国药品生物制品检定所。Methylnissolin 3-O-glucosid（F10），黄芪皂苷I（Astragaloside I，S14），黄芪皂苷II（astragaloside II，S8），环黄芪醇（Cycloastragenol，S17）和黄芪皂苷III（astragaloside III，S7）购于上海同田生化技术有限公司。

黄芪注射液分别由6家生产厂家提供。1 mL注射剂分别相当于2 g黄芪。其中样品A1和A2工艺中使用增溶剂;样品B1，B2，B3和B4不添加任何增溶剂。

1.3 分析样品

黄芪注射液样品以甲醇稀释10倍和100倍（v/v）。在14 000 r/min离心10 min后将上清液转移到自动进样器小瓶中进行分析。标准储备溶液以甲醇制备，-4 ℃储存。

1.4 UPLC条件

Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18色谱柱（3 mm×100 mm，1.8 μm）;柱温：30 ℃;进样体积：2 μL;流动相：A为0.1%甲酸-水溶液，B为0.1%甲酸-乙腈溶液;梯度洗脱程序：0～2 min：3% B;3～17 min：3%～70% B;18～22 min：95% B;23～25 min：3% B。流速：0.4 mL/min。

1.5 Q-TOF-MS条件

质谱条件：采集模式：正模式;扫描范围：m/z 70～1 300.离子源参数：雾化气（N2）：35 psi;干燥气（N2）：流速15 L/min，温度200 ℃;鞘气（N2）：流速12 L/min，温度350 ℃;毛细管电压3.5 kV;碎裂电压250 V;CID电压：5～40 eV;参比离子：正模式：m/z121和922;负模式：m/z 112和1 033。碰撞诱导解离（CID），能量从6～70 eV，每个化合物单独优化。

1.6 数据分析

通过文献检索，建立包含可能存在的近200个蒙古黄芪和膜荚黄芪药材中所含成分的初级谱库[15-17]，数据库通过MassHunter PCDL Manager软件建立，包含化合物名称，精确分子量，分子式，分子结构。采集的数据文件通过Agilent′s MassHunter Qualitative软件与谱库进行匹配分析。

通过精确分子量匹配（<1 ppm），根据其可能的的化学结构将化合物分类。通过碰撞诱导解离（CID）得到二级谱信息，尽可能减少对化合物的误判。对于对照品可能获得的化合物，通过与标准品保留时间，二级谱匹配等信息进一步确定。对于难以获得标准品的化合物通过二级光谱与文献报道的离子碎片等进行比对。

2 结果与讨论

2.1 UPLC/Q-TOF-MS的共有化合物的分析结果

分别在正负2种模式下采集，黄芪注射液中共鉴定出46个共有化合物（图2）。根据化学结构将46种组分分为4组：氨基酸（A），黄酮类（F），皂苷（S）和其他（O）。表2为46化合物的主要碎片谱峰归属。

2.2 主要黄酮化合物的鉴定

17种黄酮类化合物分属于4种黄酮结构类型：黄酮，异黄酮，异黄烷以及紫檀烷类。二级谱质谱图中，可见丢失CH3，CO（C-4），CHO（C-OH）和脱H2O（3-OH，5-OH或m-OH，o-OH）的碎片离子。通过黄酮类C环的逆Diels-Alder（RDA）裂解，得到关于A环和B环中取代基的数量和类型的信息。

图1a和图1d显示了峰F14的一系列碎片离子（m/z 269.0808）解析机理如图所示。黄酮苷类结构较为脆弱，容易在低碰撞电压下裂解甚至在ESI离子源内碎裂，因此会同时产生苷和苷元的“[M+H]+”。因此可将黄酮苷元及糖苷进行分类分析，例如：图1中F9和F14的结构解析过程。F9（m/z 431.132 7）保留时间9.8 min。在低碰撞电压（<10 eV）下质谱相对简单，仅含有一个子离子，m/z为269.0801，与峰值F14相同（图1b）。当碰撞电压增加到60V时，F9的二级质谱显示与F14非常相似，说明F9可能在结构上与F14相似。F9比F14分子量多162 Da，推导F9可能是芒柄花苷（Ononin），并用对照品进一步确认了保留时间和质谱数据。使用上述方法又继续鉴定了另外3对类黄酮及其糖苷（F4和F12，F5和F13，F10和F15）。F1和F2具有相似的二級质谱图，且F1比F2分子量多162 Da（C6H10O6）。推测具相同苷元的不同异黄酮糖苷。

在研究中发现，黄酮类有几组同分异构体，如F2和F8（C22H22O11，m/z 463.123 5）。在数据库中，得到3个候选化合物：红车轴草素7-O-葡萄糖苷（pratensein 7-O-glucoside），鼠李糖苷3-O-葡糖苷（rhamnocitin 3-O-glucoside）和山柰素3-O-葡萄糖苷（kaempferide 3-O-glucoside）。[M+H]-离子的二级质谱显示它们都具有分子量301.070 6（C16H13O6）的苷元碎片离子。峰F8在RDA机理中断裂的m/z 153和134碎片表明它在A环和B环中皆含有2个羟基官能团，所以红车轴草素7-O-葡糖苷是唯一的结果。

参考文献[18]，F2可鉴定为鼠李糖苷3-O-葡糖苷。F3和F4具有非常相似的结构，将保留时间与对照品进行比较，确认F4为毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷（calycosin-7-O-glucoside），而F3可能为3′-hydroxy-5′-methoxyisoflavone-7-O-glucoside。

2.3 主要皂苷类化合物的鉴定

黄芪中大部分皂苷类成分均属于C-17位带有一个呋喃环的环阿屯烷型四环三萜皂苷。通常情况下，环阿屯烷类皂苷在0.1%甲酸-乙腈系统中，正模式下具有显著的[M+Na]+和较低丰度的[M+H]+;或者负模式下显著的[M+COOH]-。另外，皂苷类结构在ESI+模式下特征显著，由于其母离子在离子源内容易碎裂，即使在较为温和的条件下，质谱图上也会表现为一簇一簇的碎片离子[15]。而此类皂苷类结构的质谱行为恰好可以作为一个快速识别及判断环阿屯型皂苷类结构存在的方法。本研究中，皂苷类结构出峰时间在11分钟以后，其结构分析采用正负2种模式下分别采集质谱信息相结合分析。

以黄芪甲苷IV（S4，Astragaloside IV）为代表的皂苷类成分，质谱中碎裂特征明显。图2所示正模式的质谱图上出现规律的成簇的复杂离子信号，低碰撞能量的二级谱与之几乎相同。A组中为母离子及其一系列脱水离子信号;B组中为母离子脱去C-6葡萄糖或者C-3木糖，以及其一系列的脱水离子信号;C和D组几乎可以在所有以环黄芪醇m/z 437.341 4（C30H45O2）为苷元的黄芪皂苷中观察到的一组信号，其中C组包含苷元离子碎片以及其一系列脱水离子的信号;D组主要为2个环黄芪醇骨架的特征离子碎片m/z 143.106 7（C8H15O2）和125.096 6（C8H13O），是C-17和C-20之间断裂产生的呋喃环的离子碎片。另外，采集负模式下的[M+COOH]-离子的二级谱，可以获得苷元离子碎片489.357 7（C30H50O5，），以及脱木糖的[M-H-xyl]-离子碎片 m/z 651.412 3（C36H59O10）。一般皂苷C-3位的苷键较C-6位容易断裂[19]。从而可以区别与黄芪甲苷为同分异构体的黄芪皂苷III（S7）。

同类型皂苷分析发现，环阿屯型皂苷的质谱行为具有极强的规律性，具有相同苷元骨架，且裂解途径相同。通过正负模式下综合分析，可以基本确认环阿屯型皂苷存在。正模式下，即可通过其离子源内裂解产生的成簇存在的碎片离子;以及通过提取特征碎片离子m/z 437.341 4，143.106 7和125.096 6快速的定位以及辨认环阿屯型皂苷。如图3所示，通过提取特征离子437.3414可以定位大部分环阿屯型皂苷。而负模式下采集的二级谱信息，可以提供皂苷上糖连接位置以及类型的信息。通过上述方法综合分析，本研究在黄芪注射液中中共分析得到16个环阿屯型皂苷和一个齐墩果烷型皂苷，其中5个化合物与标准品确证。

此外，我们还观察到实验中异构体的相互转化（S6和S7;S8，S12和S13;S14，S15和S16）。在室温下储存数小时后，对照品溶液中发生异构化现象（图4）：S7部分转化为S6;S8转换为S12，S13;并且S14转换为S15，S16。异构体通常在黄芪注射液中共存，其不稳定性可能是由糖苷键或乙酰基的异构化或分子构型的变化引起的。并且实验中发现甲醇溶液提取黄芪皂苷可以抑制异构现象的发生，而水溶液提取黄芪皂苷时会促进异构现象发生。

2.4 氨基酸及其他化合物的鉴定

基酸类成分在反柱上一般难以保留和分离。使用高分辨率质谱可将氨基酸类成分从复杂的背景信号中提取出来，但由于基质效应影响严重并不能很好的识别和鉴定。本研究中共分析得到10种氨基酸化合物。通常氨基酸类成分在甲酸系统正模式下表现为较强的[M+H]+，二级谱中主要以[M+H-COOH]+或[M+H-NH3]+离子碎片为主。其中9个化合物与对照品保留时间以及质谱相关信息确证。

黄芪注射液中还存在烟酸（O1），尿嘧啶（O2），和腺苷（O3）。均与标准品比对，确证。另外，O4（C10H14N2O5）在黄芪相关文献中并未发现相关信息，其分子式与胸苷一致，但碎片离子与胸苷标准品不一致。

3 结论

本研究中采用UPLC/Q-TOF/MS法，研究建立了黄芪注射液快速准确成分分析方法。在研究方法条件下，在6个厂家注射液中共分析得到46个共有化合物，其中24个已通过标准品验证。研究中还归纳了不同类型化合物质谱裂解规律，为同类型化合物成分分析提供参考。

基于成分分析结果，发现6厂家黄芪注射液产品质量非常大。除黄芪药材质量的影响因素外，各厂家生产工艺不同，应该是注射液产品质量影响的主要因素。因此，统一黄芪注射液生产工艺是非常必要的。另外添加增溶剂，可以极大的改善黄芪甲苷等皂苷类成分的含量，但注射液中使用吐温80等增溶剂存在一定風险[20]。另外在研究中发现，部分环阿屯烷型皂苷在水溶液中的异构现象;对黄芪注射液工艺改进具指导意义。

参考文献

[1]赵凤杰.黄芪的药效成份及药理作用研究[J].中国保健营养，2017，27（25）：22.

[2]马军，曾东汉，樊光辉.黄芪注射液治疗病毒性心肌炎随机对照试验的系统评价[J].世界中西医结合杂志，2018，13（12）：1653-1657.

[3]徐银祯，李兰芳，党万军.黄芪注射液对老年高血压患者血管功能及左心室重塑的影响[J].内科，2018，13（6）：843-846.

[4]Fu J，Wang Z，Huang L，et al.Review of the botanical characteristics，phytochemistry，and pharmacology of Astragalus membranaceus（Huangqi）[J].Phytotherapy Research Ptr，2015，28（9）：1275-1283.

[5]吕冬宁.黄芪注射液治疗肾脏疾病的应用概况[J].广西中医药大学学报，2018，21（2）：95-98.

[6]韩蓉，朱路佳，潘建新，等.黄芪注射液的急性毒性和长期毒性试验[J].中国野生植物资源，2004，23（4）：50-53.

[7]曹玉梅，曹秀娟，黄瑞华，等.黄芪注射液联合阿托伐他汀治疗早期糖尿病肾病的临床效果[J].中国医药，2016，11（4）：543-546.

[8]陈仲曦.浅析黄芪注射液的药理作用及临床应用效果[J].当代医药论丛，2016，14（15）：101-102.

[9]张伽妹，郭晓宇，全庆华，等.基于LTQ-Orbitrap高分辨质谱技术的柘木化学成分分析[J].质谱学报，2018，39（5）：599-606.

[10]孙志，周霖，李卓伦，等.基于超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱技术的脑心通胶囊化学成分研究[J].中国药学杂志，2018，53（19）：1687-1695.

[11]Li Z，Guo X，Cao Z，et al.New MS network analysis pattern for the rapid identification of constituents from traditional Chinese medicine prescription Lishukang capsules in vitro and in vivo based on UHPLC/Q-TOF-MS[J].Talanta，2018，189（1）：606-621.

[12]Wang J，Jiang W，Liu Z，et al.Analysis and identification of chemical constituents of fenugreek by UPLC-IT-MS，n，and UPLC-Q-TOF-MS[J].Chemical Research in Chinese Universities，2017，33（5）：721-730.

[13]Feng F，Li W，Sun Y，Zhang F.Non-targeted screening and determination of steviol glycosides in Chinese liquor and beverages by ultra high performance liquid chromatography-quadrupole/Orbitrap mass spectrometry[J].Se Pu，2019，37（1）：82-92.

[14]胡紫艳，田稷馨，李小丽.LC-MS联用技术在中药非目标化学成分分析中的研究进展[J].中草药，2011，42（1）：180-184.

[15]Jing L，Zhong-Zhen Z，Hu-Biao C.Review of Astragali Radix[J].Chinese Herbal Medicines，2011，3（2）：90-105.

[16]张纲，胡雪娇，姜国志，等.液质联用分析黄芪注射液中的有机小分子化学成分[J].中国现代中药，2016，18（4）：410-414.

[17]Xing X，Sun Z，Yang M，et al.Quantitative Evaluation of Twelve Major Components of Sulfur-Fumigated Astragali Radix with Different Durations by UPLC-MS[J].Molecules.2018 Oct 11;23（10）.pii：E2609.

[18]C.Chu，H.X.Cai，M.T.Ren，E.H.Liu，B.Li，L.W.Qi，P.Li，Characterization of novel astragaloside malonates from Radix Astragali by HPLC with ESI quadrupole TOF MS，J.Sep.Sci.（2010）570-581.

[19]Xie G，Plumb R，Su M，et al.Ultra-performance LC/TOF MS analysis of medicinal Panax herbs for metabolomic research[J].J Sep Sci.2008，31（6-7）：1015-1026.

[20]包敏，陳阳桔.探索鱼腥草注射液中的过敏原成分及其致敏机理[J].中国卫生标准管理，2017，8（12）：126-127.