锌指蛋白mA20突变体对内毒素性肺泡巨噬细胞的调控作用

左云龙 党润 彭红艳 武志远 杨镒宇

[摘要]目的：探讨锌指蛋白mA20突变体对内毒素性肺泡巨噬细胞的调控作用;方法：分别设立A：NS对照组，B：空白脂质体处理组，C：脂质体+绿色荧光蛋白质粒处理组，D：脂质体+绿色荧光蛋白。锌指蛋白mA20突变体质粒处理组;按文献制备脂质体/GFP质粒复合物、脂质体/GFP-锌指蛋白mA20质粒突变体复合物，分别处理C、D组;结果：4组的内毒素性肺泡巨噬细胞数及IL-1B相比差异具有显著性（P>0.05）;将携带mA20基因的病毒载体转染肺泡巨噬细胞（mA20过表达肺泡巨噬细胞），感染后，可在荧光显微镜下观察到绿色荧光;结论：内毒素性ALI的难题与根本问题就是炎症级联效应，而改善此类患者的有效措施就是阻断炎症级联效应的通路，锌指蛋白mA20突变体在通路中具备较好的阻断作用。

[关键詞]锌指蛋白mA20突变体;内毒素性肺泡巨噬细胞;调控作用

[中图分类号]R72 [文献标识码]A [文章编号]2096-5249（2019）05-016-02

急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征（acute lung injury/acute respiratorydistress syndrome，ALI/ARDS）系指患者在承受各种病理性刺激反应在之后诱发急性炎症，主要的临床症状是缺氧及呼吸困难。锌指蛋白mA20主要发挥炎症调控的作用，是机体中非常重要的内源蛋白，能够有效抑制NF-B，如此便能够有效改善炎症细胞因子的“瀑布样”级联症状。现今，分子生物学水平渐渐提升，本文基于此，深入探究锌指蛋白mA20对内毒素性ALI时肺组织保护性机理，以期为ALl的防治奠定坚实的实验及理论基础。

1材料

1.1质粒的准备 ①依照《分子克隆》自制JMl09感受态;②GFP及mA20质粒的转化测验;③GFP及mA20质粒扩增、提取，琼脂糖凝胶电泳鉴定;④凭借酶切及连接的手段，制备表达富含GFP-mA20突变体的融合蛋白，并且进行扩增，展开琼脂糖凝胶电泳及测序鉴别。④内毒素选择中剂量（2.5mg/kg）。

1.2支气管肺泡灌洗 所有研究大鼠均展开肺泡灌洗，并且依照分离、纯化、贴壁、分装的次序进行培养。研究分组主要分成三组，分别是高剂量（5mg/kg）、中剂量（2.5mg/kg）、低剂量（0.5mg/kg），并且以分组的方式攻击SD大鼠PAM;形成各个浓度范围内的毒素性PAM细胞模型。

1.3纯化、培养皿分装培养 设置A：NS对照组，B：空白脂质体处理组，C：脂质体+绿色荧光蛋白质粒处理组，D：脂质体+绿色荧光蛋白-锌指蛋白mA20突变体质粒处理组;依照相关研究自制脂质体/GFP-锌指蛋白mA20质粒突变体复合物、脂质体/GFP质粒复合物，并针对C、D组分别采取处理。

1.4观察指标 将PAM培养的上清液采集，ELISA针对Ⅱ-1及TNF-α的表达水平进行检测;运用荧光显微镜测定采集的细胞，利用绿色荧光的特征性反应，区别质粒转染的状况;IL-1及TNF-α引物设计，凭借RT-PCR进行扩增进而得到目标片段，琼脂糖凝胶电泳鉴定;凭借Tripure试剂获得PAM总RNA，RT-PCR，扩增得到首条cDNA。

1.5质量控制 研究大鼠均选择清洁型SD大鼠，并且由专业人士根据细胞培养与分子生物学的流程开展研究;为能够有效提升基因转染率，凭借新型阳离子脂质体介导基因进行AM的转入操作;运用进口试剂进行测试，保障数据的准确性及可靠性;重复进行5-10次实验，降低了结果误差，测试重复性也较好。

1.6统计学处理 用均数±标准差表示数据，并且凭借spss软件展开统计学分析，最终运用条形图、线形图、荧光显微镜图片以及表格等展示测试结果。

2结果

4组的内毒素性肺泡巨噬细胞数相比差异具有显著性（P<0.05），见表1.4组肺组织匀浆IL-1B测定结果相比差异具有显著性（P<0.05），见表2.将携带mA20基因的病毒载体转染肺泡巨噬细胞（mA20过表达肺泡巨噬细胞），图分别为感染3h、6h、12h、24h后的情况。见图。

将携带mA20基因的病毒载体转染肺泡巨噬细胞（mA20过表达肺泡巨噬细胞）。感染后。可在荧光显微镜下观察到绿色荧光。见下图

3讨论

3.1目前研究现状和存在问题 目前防治内毒素性ALI的根本难题是不能有效的控制炎症因子的“级联放大”的瀑布样反应，导致肺损伤加重，最终诱发或加重多脏器功能障碍综合征（MODS）。当前国内外研究主要集中在如下几方面：①常规用各种机械通气的方法支持治疗，但在没解决感染的根本问题时，该方法的远期效果不理想，而且还容易带来高氧肺损伤的并发症;②也有众多学者采用抗免疫疗法，虽取得了很大的进展，但由于治疗时机、抗炎抑炎的平衡难以把握，抑炎措施单一，致使有相当部分效果不甚明显，ALI/ARDS病死率仍无显著改善;③虽然抗生素治疗是有效的措施，但随着药物的滥用，出现了相当多的耐药细菌。这使得抗生素的使用遇到很尴尬的境地;④外源性肺表面活性物质（PS）的替代疗法是近来较为先进的治疗措施，但由于剂型、给药途径不一，操作较烦琐以及费用较为昂贵等原因，使得PS替代疗法难以广泛应用;⑤化痰药、扩血管药物的应用只能对症支持，不能有效解决根本的炎症问题;还常常会由于多数扩血管药物缺乏对肺循环的选择性作用而加重低氧血症;⑥蛋白酶抑制剂的应用对ALI的治疗效果仍有争议。⑦临床中多用的抗氧化治疗也只是个辅助措施。

回顾以往的研究多集中在如何抗感染、保护肺功能、对症支持以及辅助治疗，多是很“被动”的措施，而对如何从根本上阻断ALl炎症反应通路的研究甚少。随着分子生物学的发展，在分子水平上对炎症反应进行合理调控成为当前热点。

3.2锌指蛋白mA20突变体是新型结构简单的炎症调控物质目前。社会各界非常注重免役源性因素，例如趋化因子、细胞因子、炎症细胞在内毒素性ALI时炎症反应阶段中所发挥的调控作用，虽然能由基因层次有效调控炎症反应，可是对内毒素性ALl炎症反应阶段中的特定位点运用某一内源性调控蛋白而开展的试验及研究鲜少。已经有相关研究证实锌指蛋白mA20是一种胞浆炎症调控蛋白。并且根据有关报道可知锌指蛋白mA20是胞液内的泛素修饰蛋白。能够表现出负调控NF-B的效果，在负调控炎症中尤为关键。针对mA20基因功能及结构进行深入的探究之后得知：mA20功能结构域共有两个。分别是mA20的C末端半区（386-775）及N末端半区（1-385）;C半区是锌指区，Cys2/Cys2型锌指的数量有7个，并且结构均是重复的。设置了mA20突变体表达质粒并转染炎症细胞模型，得知mA20对NF-B活性抑制和C半区中ZnF存在较为密切的关联性，并且若是突变体存在ZnF不少于4个，对NF-B活性所发挥的抑制效果几乎等同于存在7个ZnF野生型mA20.可是根据相关报道可知mA20的N端卵巢肿瘤（OUT）域存在较强的去泛素化活性，并且此信号与NF-B信号的抑制效果并不存在关联性，此外，这两个信号可以证实mA20可以使得被多泛素化的RIPl有效消除，这也是在7NF介导过程中NF-B活化抑制效果的体现。另外，在转染测试过程中野生型mA20会对RIPl产生促进作用，并且会因此出现稳定性显著降低的结果。mA20与RIPl去泛素化、再泛素化之间存在较为密切的关联性，如此便能抑制NF-B，表现出较强的抗炎效果。

3.3锌指蛋白A20突变体防治内毒素性ALl的可能机制 肺巨噬细胞（PAM）是LPS攻击进而诱发急性肺受损的一种重要效应细胞，由于PAM在LPS存在的条件下释放IL-1、TNF-α、前列腺素（PG）、IL-8、IL-6、补体C3等炎症介质，进而诱发严重的炎症“级联”瀑布样效应。野生型mA20现今已经证明是NF-B的负调控胞内蛋白，进而导致下游转录而产生的各项炎症因子水平降低，实现抗炎目标。但是mA20突变体是不是可以对内毒素诱导PAM活化阶段过程中的级联放大“瀑布样”效应产生有效的阻隔作用，现在并没有相关研究可以证实。

本组资料显示，4组的内毒素性肺泡巨噬细胞数、肺组织匀浆IL-1B测定结果以及肺组织匀浆TNF alpha测定结果相比差异均具有显著性（P<0.05）。简而言之，内毒素性ALI的难题与根本问题就是炎症级联效应，而改善此类患者的有效措施就是阻断炎症级联效应的通路，锌指蛋白mA20突变体在通路中具备较好的阻断作用。