养脑宁心颗粒质量标准研究

赵锐 张丽

摘要 目的：建立养脑宁心颗粒的质量标准。方法：选取薄层色谱法方法养脑宁心颗粒处方中牡丹皮、山茱萸、枸杞子进行定性鉴别;用高效液相色谱法测定养脑宁心颗粒中葛根指标性成分葛根素的含量。结果：在薄层色谱图中，在与对照药材色谱图相应的位置上，可见相同颜色的牡丹皮、山茱萸、枸杞子荧光斑点相对应;葛根素进样量0.23～1.15 μg，呈良好的线性关系，r=0.999 9，平均回收率：98.5%，RSD为0.81%。结论：该方法简单易行，重复性良好，可作为养脑宁心颗粒制剂质量控制标准。

关键词 养脑宁心颗粒;葛根;葛根素;牡丹皮;山茱萸;枸杞子;薄层色谱法;高效液相色谱法

Abstract Objective：To establish the quality standard of Yangnao Ningxin Granules.Methods：TLC method was used to qualitatively identify the Cortex Moutan Radicis，Fructus Corni and Fructus Lycii in the prescription.The content of puerarin in peony was determined by HPLC.Results：In the thin-layer chromatogram，the corresponding spots of the corresponding color of the Cortex Moutan Radicis，Fructus Corni and Fructus Lycii spots correspond to the same color; the puerarin injection volume was 0.23～1.15 μg，showing a good linear relationship（r=0.999 9），average recovery：98.5%，RSD 0.81%.Conclusion：The method is simple，easy to repeat，and can be used as a quality control standard for the preparation.

Key Words Yangnao Ningxin Granule; Radix Puerariae; Puerarin; Cortex Moutan Radicis; Fructus Corni; Fructus Lycii; TLC; HPLC

中圖分类号：R289.5 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.07.007

养脑宁心颗粒由葛根、山茱萸、牡丹皮、枸杞子、甘草等多味中药材组成，具有滋养心肾、安神定志的功效，临床上主要用于心肾阴虚型头晕耳鸣、健忘失眠、腰膝酸软等症。方中熟地黄、山茱萸、枸杞子、麸炒山药、白芍滋补肝肾、养血益精、补脾益气;茯苓、柏子仁养心安神、健脾;葛根、牡丹皮清热凉血、生津止渴;配以甘草补脾益气、调和诸药;全方共奏滋养心肾、安定神志之功效。方中以大量使用的葛根为君药，葛根为豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根，多于秋、冬二季采挖。味甘、辛，性凉。归脾胃肺经，具有解肌退热、生津止渴，透疹，升阳止泻的功效，临床多用于外感发热、口渴、消渴等症[1]，其主要成分为皂苷类、异黄酮类及三萜类，其中异黄酮类为葛根的主要活性成分，包括葛根素、3-羟基葛根素、葛根素-木糖苷、3-甲氧基葛根素等[2]。现代药理学研究发现，葛根素可明显提高心肌细胞P9C2eNOS蛋白和基因表达，通过调节一氧化氮含量及其合酶表达，从而发挥对心血管系统的保护作用，还可通过调节垂体后叶素的分泌，降低心律失常的发生[3-4]。现代研究还发现葛根素还具有解热、镇痛、降血糖、降血脂、抗氧化等药理作用[5-8]。

养脑宁心颗粒是陕西中医药大学第二附属医院心脑血管专家，以辨证论治为基础，根据中医药理论，结合临床实践，总结多年的经验组方。临床使用疗效显著，不良反应小，为适应现代化发展及众多患者的需求，我们将传统的中药汤剂进行剂型改良，改良后的颗粒剂方便患者的携带和服用，也在一定程度上改善了该药的口感，市场前景广阔，具有开发意义。为了控制养脑性心颗粒的质量，保证其疗效，该试验从薄层色谱定性实验和高效液相色谱定量实验入手，探讨该制剂的质量标准，从而为临床应用提供可靠的试验资料和数据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 ZF-20D型暗箱式紫外分析仪（上海光豪分析仪器有限公司），DYQC型医用超声波提取器（连云港欧倍洁医疗设备有限公司），十万分之一电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），DHG-9140型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）。

1.2 试剂 本实验中所用甲醇为色谱纯，乙醇等化学试剂均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

1.3 分析样品 牡丹皮照药材（批号121490-201102）、山茱萸对照药材（批号121495-201303）、枸杞子照药材（批号121072-201410）、葛根素（批号110752-201615）购于中国药品生物制品检定所。养脑宁心颗粒样品（批号160426、160427、160428）由陕西中医药大学第二附属医院制剂室生产提供。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 牡丹皮的薄层色谱鉴别 养脑宁心颗粒研细，准确称取粉末5.6 g，置于圆底烧瓶中，量取并加入乙醚50 mL，加热回流1 h，滤过，滤液低温挥发干，精密量取正己烷0.5 mL使残渣溶解，即为供试品溶液。称取牡丹皮对照药材4.3 g，木香对照药材溶液的制备方法同上。参照《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0502，精密吸取供试品溶液4 μL、木香对照药材溶液5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（30～60 ℃）-丙酮-乙酸乙酯（84：15：1）为展开剂，预饱和15 min，展开，取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视[9-10]。供试品色谱中，可见相同颜色的斑点与对照药材色谱的斑点相对应，且位置相同。见图1。

2.1.2 山茱萸的薄层色谱鉴别 养脑宁心颗粒研细后，准确称取5.2 g粉末，置于具塞的锥形瓶中，量取并加入10 mL无水乙醇，放入超声仪中15 min，滤过，滤液蒸干，精密量取2 mL无水乙醇使残渣溶解，即为供试品溶液。称取山茱萸对照药材2.8 g，山茱萸对照药材溶液制备方法同上。参照《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0502，精密吸取供试品溶液、山茱萸对照药材溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇-冰醋酸（50∶ 10∶ 1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷显色剂5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中可见紫红色的斑点与对照药材相对应，且位置相同。见图2。

2.1.3 枸杞子的薄层色谱鉴别 取适量养脑宁心颗粒研细，准确称取粉末5.4 g，置于烧瓶中，量取并加入35 mL水，煮沸15 min，放冷，滤液放于分液漏斗中，量取乙酸乙酯15 mL振摇提取，分取乙酸乙酯液，置水浴锅上浓缩至1 mL，即为供试品溶液。称取枸杞子对照药材0.57 g，枸杞子对照药材溶液制备方法同上。参照《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0502，精密吸取供试品溶液、枸杞子对照药材溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸（3：2：1）为展开剂。展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中可见相同颜色的斑点与对照药材相对应，且位置相同。见图3。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱为：Angilent C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）;流动相：甲醇-水（25：75），柱温：30 ℃，检测波长：250 nm，理论板数按葛根素峰计应不低于3 000[11-14]。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取葛根素对照品4.633 mg，置于100 mL容量瓶，30%乙醇溶液定容，制成每100 mL含4.633 mg的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 养脑宁心颗粒研细，精密称取粉末1.234 4 g，置于锥形瓶中，移液管移取50 mL的30%乙醇，加入锥形瓶，密塞，准确称量并记录，放入超声仪，30 min后取出，放凉，称量并记录，用30%乙醇补足此过程减少的重量，充分摇匀，取续滤液，即为供试品溶液。

2.2.4 专属性试验 精密量取葛根素对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液各10 μL，分别注入高效液相色谱仪，设定方法，测定，根据高效液相图谱，阴性对照样品在葛根素相对保留时间处未见色谱峰，结果显示阴性样品对该方法检测几乎无干扰。见图4。

2.2.5 线性关系考察 精密吸取葛根素对照品溶液（C=46 μg/mL）5、10、15、20、25 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以葛根素对照品溶液的进样量（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。得出葛根素回归方程Y=3 378.5X+23.745，r=0.999 9，结果表明葛根素对照品溶液进样量在0.23～1.15 μg，峰面积线性关系良好。见表1。

2.2.6 中间精密度试验 取批号为161105的养脑宁心颗粒，制备供试品溶液，连续进样5次，每次精密吸取10 μL，按上述条件测定，葛根素峰面积的RSD：0.06%。见表2。

2.2.7 供试品溶液稳定性试验 养脑宁心颗粒批号161105的供试品溶液，精密移取5 μL，分别于0、4、8 h进样，测定养脑宁心颗粒中，葛根素的峰面积。葛根素峰面积RSD为0.26%，即养脑宁心颗粒供试品溶液稳定性在8 h内良好。

2.2.8 重复性试验 养脑宁心颗粒批号161105的样品，均匀分为6份，制备供试品溶液，每次精密量取10 μL，进样，测定，根据结果：葛根素平均含量为5.560 28 mg/g，RSD为1.97%。

2.2.9 回收率试验 取批号为161105的养脑宁心颗粒样品，均匀分为9份，已知葛根素5.602 8 mg/g，称取样品约1 g，6份养脑宁心颗粒样品中精密加入一定量的葛根素对照品溶液进行测定，并计算回收率，根据结果计算，平均回收率：98.50%，RSD：0.81%。见表3。

2.2.10 样品测定结果 养脑宁心颗粒3批样品，生产批号分别为161030、161105、161109，制成供试品溶液，注入液相色谱仪，测定峰面积积分值，用外标法计算养脑宁心顆粒中葛根素质量分数。见表4。

根据3批养脑宁心颗粒含量测定的结果，暂定养脑宁心颗粒每袋含葛根以葛根素（C21H20O9）计，不得少于40 mg。

3 讨论

3.1 提取溶剂浓度的确定 通过预实验，我们对养脑宁心颗粒供试品溶液制备过程中，提取溶剂的浓度进行了方法学的考察及验证，预实验结果显示：30%乙醇提取的养脑宁心颗粒供试品中葛根素的含量高于70%乙醇或甲醇作为提取溶剂，制备的养脑宁心颗粒供试品中葛根素的含量，故结合《中华人民共和国药典》2015年版1部，选定30%乙醇为该实验的提取溶剂[15-17]。

3.2 供试品溶液制备方法的确定 取养脑宁心颗粒适量，研细后，精密称取1.237 8 g、1.400 5 g、1.302 7 g，分别放于圆底烧瓶及具塞的锥形瓶中，分别用移液管量取并加入30%乙醇50 mL，准确称量并记录，圆底烧瓶放入水浴锅加热回流30 min、锥形瓶放入超声仪，于超声30 min、45 min后取出，放凉，分别称量并记录，用30%乙醇补足此过程减少的重量，充分摇匀，取续滤液，即为供试品溶液。分别检测3种提取方法制备的供试品中葛根素的含量。结果显示，超声30 min制备的养脑宁心颗粒供试品中葛根素的含量与超声45 min、加热回流30 min供试品中葛根素的含量几乎相同，提示超声30 min供试品中葛根素已完全提取，葛根素的含量并不随超声时间的延长而增加，根据简便易行的原则，故选30%乙醇超声30 min作为制备养脑宁心颗粒供试品的制备方法。

本实验从薄层色谱鉴别和含量检测2方面入手，对处方中牡丹皮、山茱萸、枸杞子3味中药材进行薄层色谱鉴别，对处方中君药葛根进行指标性成分葛根素含量的测定，从而建立该制剂的质量标准。该试验方法操作简单、重复性高，结果稳定，可用于同种剂型中药制剂的质量检测。目前大多数中药制剂主要从薄层色谱定性鉴别和高效液相色谱法含量检测两方面入手，选取制剂处方中的部分药材进行检测，制定其质量标准。

中药制剂主要为复方制剂，以辨证论治为基础，根据中医药理论组方而成，大多数的院内制剂，为临床使用的经验方，长期临床应用疗效显著，不良反应小，深受患者的好评，但是传统中药以汤剂为主，其口感差，携带不便等缺点降低了患者服药的依从性。随着近年来中药制剂的现代化发展及院内制剂的开发，越来越多的经方、验方被人们发掘出来，为了适应现代化的发展及患者的服用及携带需求，中药汤剂被逐渐改良为现代剂型，同时对中药制剂的质量要求也越来越高，为了确保其原有疗效及临床使用的安全性，运用现代化技术探讨并建立其质量标准，检测中药制剂中指标性成分及其含量范围，对确保中药制剂的质量及稳定性生产具有重要意义。

养脑宁心颗粒由葛根、牡丹皮、山茱萸、枸杞子等10味中药材配伍而成，其发挥的作用是处方中各味中药材共同作用的结果，而且中药成分复杂，为了更进一步研究发挥作用的有效成分及物质基础，这就要求我们在今后的试验研究中，从处方中各味中药材入手，根据中医药理论及药物之间的配伍关系，运用多种检测方法对其进行研究，从而制定更完善的质量标准，为临床安全使用提供可靠的数据和试验研究资料。

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（2018-05-10收稿 责任编辑：杨觉雄）