奶牛源金黄色葡萄球菌新疆流行株生物被膜形成及相关基因的分布与转录水平

伍晔晖 孟庆玲 乔军 李静 蔡扩军 王登峰 才学鹏

摘要：【目的】了解金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）临床分离株的生物被膜形成情况及黏附素和ica操纵子与生物被膜形成能力的相关性，为系统掌握新疆地区奶牛源SA流行株的分子特征及有效防治奶牛乳房炎提供科学依据。【方法】收集临床分离鉴定的164株SA新疆流行株，采用结晶紫半定量黏附试验（MPA）测定各流行株的体外生物被膜形成能力，同时通过PCR和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对SA生物被膜形成相关基因转录水平进行检测分析。【结果】164株奶牛源SA新疆流行株的生物被膜阳性率为86.0%（141株），其中弱（+）生物被膜形成有69株（占42.1%）、中等（++）生物被膜形成有38株（占23.2%）、强（+++）生物被膜形成有34株（20.7%）。在141株MPA阳性SA分离株中，clfA、clfB、fnbA、fnbB、cna、fib、icaA、icaC和icaD基因检出率分别为83.7%（n=118）、58.9%（n=83）、75.2%（n=106）、78.7%（n=111）、75.9%（n=107）、58.9%（n=83）、90.1%（n=127）、79.4%（n=112）和100.0%（n=141）;ica基因（icaA、icaC和icaD）检出率总体上高于其他生物被膜形成相关基因，且生物被膜形成能力强（+++和++）的菌株尤为明显;clfB、fnbA、cna和fib基因检出率则表现为MPA阴性菌株高于MPA阳性菌株。9个生物被膜形成相关基因中有7个基因（clfA、fnbA、fnbB、fib、cna、icaC和icaD）在强（+++）生物被膜形成能力SA分离株中的表达量显著上调（P<0.05）。【结论】奶牛源SA新疆流行株生物被膜形成率高，生物被膜形成相关基因携带率也较高，其中clfA、fnbA、fnbB、fib、cna、icaC和icaD基因的表达与SA生物被膜形成密切相关。

关键词： 金黄色葡萄球菌;生物被膜;黏附素;转录水平;新疆

中图分类号： S852.611                           文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）08-1829-07

Analysis of biofilm formation， related genes distribution and transcription level in Xinjiang isolates of Staphylococcus aureus from cows

WU Ye-hui1， MENG Qing-ling1， QIAO Jun1*， LI Jing1， CAI Kuo-jun2，

WANG Deng-feng3， CAI Xue-peng4

（1College of Animal Science and Technology， Shihezi University， Shihezi， Xinjiang  832003， China; 2Animal Disease Control and Diagnosis Center in Urumqi， Urumqi  830063， China; 3Institute of Veterinary Medicine， Xinjiang Academy of Animal Science， Urumqi  830000; 4Lanzhou Veterinary Research Institute， Chinese Academy of

Agricultural Sciences， Lanzhou  730046， China）

Abstract：【Objective】The aim of the study was to detect biofilm formation and correlation between adhesin， ica operon with biofilm formation ability of the clinical isolates of Staphylococcus aureus（SA）， which would provide an insight into molecular characteristic of SA strains of dairy cows in Xinjiang and provide a scientific basis for the prevention and treatment of dairy cow mastitis. 【Method】The 164 strains of SA strains in Xinjiang from clinical isolates were collected. The in vitro biofilm formation ability of the bacteria were then evaluated by a microtiter plate assay（MPA）， and the biofilm-associated genes were detected by PCR and real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR）. 【Result】The positive rate of biofilm formation was 86.0%（141 isolates） among the 164 SA isolates in Xinjiang from cows. Of the 141 biofilm positive isolates， 69（42.1 %） were weak（+） biofilm formation， 38（23.2%） were medium（++） biofilm formation and 34（20.7%） were strong（+++） biofilm formation， respectively. Among 141 MPA-positive SA isolates， the detection rates of biofilm-associated genes clfA， clfB， fnbA， fnbB， cna， fib， icaA， icaC and icaD were 83.7%（n=118）， 58.9%（n=83）， 75.2%（n=106）， 78.7%（n=111）， 75.9%（n=107）， 58.9%（n=83）， 90.1%（n=127）， 79.4%（n=112） and 100.0%（n=141）， respectively. The detection rates of ica genes（icaA， icaC and icaD） were higher than those of other biofilm-associa-ted genes， and the strains with strong biofilm formation ability（+++ and ++） were particularly obvious. The detection rate of clfB， fnbA， cna and fib genes was higher in MPA-negative strains than in MPA-positive strains. Among the nine bbiofilm-forming related genes， seven biofilm-forming genes（clfA， fnbA， fnbB， fib， cna， icaC， and icaD） were significantly up-regulated in the SA isolates with strong（+++） biofilm-forming ability（P<0.05）. 【Conclusion】The formation rate of SA biofilm from dairy cows in Xinjiang is high， and the biofilm formation-related genes have a high carrying rate. The expression of clfA， fnbA， fnbB， fib，cna， icaC and icaD genes is closely related to biofilm formation.

Key words： Staphylococcus aureus; biofilm; adhesion; transcription level; Xinjiang

0 引言

【研究意义】金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是引起奶牛临床和亚临床乳房炎及子宫内膜炎的主要病原之一，对奶牛养殖业和乳制品行业造成严重威胁，我国因隐性乳房炎造成的牛奶损失占泌乳奶牛年产量的10%～11%，在美国其造成的年经济损失达10亿美元（薛俊欣，2010;Pereira et al.，2011）。新疆是我国的重要奶源地之一，2015年奶牛存栏185万头，占全国的13.5%，居第二位;牛奶总产量155.77万t，占全国的4.15%，居第六位;乳品总产量43.23万t，比2010年增长42.67%（陆东林和罗永明，2017）。因此，加强SA新疆流行株研究对确保新疆奶牛养殖业健康具有重要意义。【前人研究进展】为降低SA感染率，国内外学者开展了大量有关SA侵染和黏附宿主细胞的研究工作，并取得一些重要进展。Joshi等（2018）研究发现，SA进入乳腺后通过黏附素附着于上皮细胞受体上，引发SA释放多种毒素和细胞外酶，进一步加重乳腺组织的损伤;同时，附着在细胞表面的菌体可形成生物被膜（Biofilm，BF），而增强SA对抗生素的耐受性，逃避宿主免疫系统的清除作用。胞间黏附（Intercellular adhesion，ica）在SA中普遍存在，是生物被膜形成的必要因素。SA形成生物被膜一般分两步进行：第一步是依赖其表面识别黏附基质分子（Microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules，MSCRAMM）黏附于乳腺上皮细胞;第二步是附着细菌的增殖與积累，由胞间多糖黏附素/β-1，6-聚-N-乙酰葡萄糖胺（PIA/PNAG）组成细胞外基质，并依靠ica操纵子（icaABCD）表达的酶完成生物合成（Boonyayatra et al.，2014;Waryah et al.，2016;Gogoi-Tiwari et al.，2017）。但也有学者研究报道了SA形成的ica非依赖性生物被膜，提示MSCRAMM可替代PIA介导生物被膜的形成（Laverty et al.，2013;Gogoi-Tiwari et al.，2015）。此外，Nourbakhsh等（2016）研究发现，icaA和icaD基因在不同SA菌株中的表达因生物被膜形成能力不同而存在明显差异，且认为亟待揭示黏附素clfA对促进SA定植的作用机制;Thiran等（2018）提出青霉素结合蛋白2a（PBP2a）是生物被膜积累的重要因素，而SA作为牛奶及其乳制品中产生肠毒素的主要潜在因子。因此，SA的生物被膜形成能力值得食品安全领域重点关注。【本研究切入点】至今，有关SA生物被膜形成的研究主要集中在形成机制探究，且多数以标准菌株为研究对象，而针对SA临床分离株生物被膜形成能力的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】对新疆地区奶牛源SA流行株进行生物被膜形成能力检测，并采用PCR和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对生物被膜形成相关基因进行检测分析，旨在了解SA临床分离株的生物被膜形成情况及黏附素和ica操纵子与生物被膜形成能力的相关性，为系统掌握新疆地区奶牛源SA流行株的分子特征及有效防治奶牛乳房炎提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 菌株来源

在2015—2018年期间，从新疆部分地区奶牛场采集临床乳房炎（276份）牛乳和子宫内膜炎（110份）样品共计386份，先通过选择性培养基对其病原菌进行分离和初步鉴定，再经生化试验鉴定，并进行16S rRNA序列分析得到SA临床分离株164株，-20 ℃保存于石河子大学动物科技学院寄生虫实验室。

1. 2 试验材料

Baird-Parker培养基、脑心浸出液肉汤（BHI）和胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）均购自青岛高科园海博生物技术有限公司;科玛嘉金黄色葡萄球菌显色培养基购自CHRO Magar公司;细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA Marker I、pMD19-T载体和PrimeScriptTM RT reagent Kit均购自TaKaRa公司;大肠杆菌（Eschenrichina coli）DH5α感受态细胞由石河子大学动物科技学院寄生虫实验室保存提供;结晶紫购自天津市北联精细化学品开发有限公司;96孔微量板购自上海市蔚宏生物科技有限公司;TRIzol试剂购自Ambion公司;溶菌酶购自北京博奥拓达科技有限公司;5´PCR Mix购自北京全式金生物技术有限公司;FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）购自Roche公司。

1. 3 生物被膜培养及结晶紫半定量黏附试验（MPA）

采用MPA检测SA不同分离株的生物被膜形成能力。用无菌接种环挑取单个菌落接种于TSB培养基中，振荡培养过夜。活化菌液按1∶100比例转接至TSB肉汤中继续培养，使其OD600 nm达0.2左右，分别吸取200.0 μL菌液加入到96孔微量滴定板中，37 ℃静置培养24 h，采用酶标仪测定其A570 nm（Stepanovic et al.，2007）。将测定结果转换成cut-out值：ODC=OD阴性对照+3´SD阴性对照;OD待检孔=OD平均-ODC。菌株生物被膜形成能力可分为四类：（1）OD待检孔≤ODC，判定为无生物被膜产生（-）;（2）ODC<OD待检孔≤2´ODC，判定为有弱生物被膜产生（+）;（3）2´ODC<OD待检孔≤4´ODC，判定为有中等生物被膜产生（++）;（4）4´ODC<OD待检孔，判定为有强生物被膜产生（+++）。

1. 4 DNA提取

将SA流行株接种至无菌BHI培养液中，37 ℃振荡过夜培养，取1.5 mL细菌培养液置于无菌EP管中，12000 r/min离心1 min，弃上清液，然后按细菌基因组DNA提取试剂盒说明提取DNA，以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其浓度和纯度。

1. 5 生物被膜相关基因检测

采用PCR对clfA、clfB、fnbA、fnbB、fib、cna、icaA、icaC和icaD等基因进行扩增，扩增引物由北京华大基因股份有限公司合成（表1）。PCR反应体系20.0 μL：5´PCR Mix 10.0 μL，DNA模板2.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 7.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性 5 min;95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，进行35个循环;72 ℃延伸10 min。采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，并在凝胶成像分析系统下观察拍照。

1. 6 生物被膜形成相关基因转录水平检测

以16S rRNA序列为内参基因，通过qRT-PCR检测SA生物被膜形成相关基因转录水平。将1.5 mL菌液置于6孔微量板中37 ℃培养24 h，菌液12000 r/min离心5 min，弃上清液。用50.0 μL TE缓冲液悬浮菌体，加入100.0 μL溶菌酶（3 mg/mL），37 ℃水浴45 min后用TRIzol提取细菌总RNA。按照PrimeScriptTM RT reagent Kit操作说明合成cDNA，-20 ℃保存备用。根据FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）说明在Roche LightCycler 480仪器上进行qRT-PCR检测，反应体系20.0 μL：SYBR Green Mix 10.0 μL，cDNA模板2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，ddH2O 6.0 μL。以16S rRNA为内参基因，各生物被膜形成相关基因为目的基因，每个样品设3个重复，采用改良的2-ΔΔCt法进行换算，并运用SPSS 21.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 结果与分析

2. 1 奶牛源SA新疆流行株生物被膜形成能力检测结果

采用MPA对164株奶牛源SA新疆流行株进行生物被膜形成能力检测，结果发现大部分菌株在96孔微量板底部可形成不同形状的紫色斑状固着物（图1-A）。OD570 nm检测结果证实，无生物被膜形成的MPA阴性SA分离株有23株（占14.0%），形成生物被膜的MPA阳性SA分离株有141株（占86.0%）;其中，弱（+）生物被膜形成有69株（占42.1%），中等（++）生物被膜形成有38株（占23.2%），强（+++）生物被膜形成有34株（20.7%）（图1-B）。

2. 2 奶牛源SA新疆流行株携带生物被膜形成相关基因检测结果

奶牛源SA新疆流行株生物被膜形成相关基因的PCR检测结果如图2所示。在141株MPA阳性SA分离株中，clfA、clfB、fnbA、fnbB、cna、fib、icaA、icaC和icaD基因检出率分别为83.7%（n=118）、58.9%（n=83）、75.2%（n=106）、78.7%（n=111）、75.9%（n=107）、58.9%（n=83）、90.1%（n=127）、79.4%（n=112）和100.0%（n=141）;在23株MPA阴性SA分离株中，clfA、clfB、fnbA、fnbB、cna、fib、icaA、icaC和icaD基因检出率分别为78.3%（n=18）、78.3%（n=18）、87.0%（n=20）、65.2%（n=15）、78.3%（n=18）、87.0%（n=20）、87.0%（n=20）、65.2%（n=15）和100.0%（n=23）。从图3可看出，ica基因（icaA、icaC和icaD）检出率总体上高于其他生物被膜形成相关基因，且生物被膜形成能力强（+++和++）的菌株尤为明显;clfB、fnbA、cna和fib基因检出率则表现为MPA阴性SA分离株高于MPA阳性SA分离株。

2. 3 奶牛源SA新疆流行株生物被膜形成相关基因转录水平检测结果

从强（+++）、弱（+）和无（−）生物被膜形成能力的SA分离株中，选取生物被膜形成相关基因检出率为100.0%的菌株[3（+++）、49（+++）、A2（+）、73（+）、45（−）和91（−）]，以45（−）作为参考株，采用qRT-PCR对SA生物被膜形成相关基因的转录水平进行检测，结果（表2）显示，在不同生物被膜形成能力菌株间，生物被膜形成相关基因的转录水平存在明显差异（平均Ct为13.61～34.13），每个基因的Ct标准偏差均<0.5。同时发现检测的9个基因中有7个基因（clfA、fnbA、fnbB、fib、cna、icaC和icaD）在强（+++）生物被膜形成能力SA分离株中的表达量显著上调（P<0.05），提示这些基因的转录水平与生物被膜形成密切相关。

3 讨论

生物被膜是SA为了适应应激环境而附着在生物或非生物表面上形成的一种特殊结构，可通过抗生素渗透限制、营养限制及形成特殊表型以抵抗抗生素，或逃避宿主免疫系统的清除作用（Bjarnsholt，2013;Moormeier et al.，2014;Howlin et al.，2015;彭丹等，2017）。MPA是半定量检测细菌生物被膜的方法，可检测黏附在酶标板表面的SA集群厚度及其牢固性（黄惟彬等，2015）。Atshan等（2012）认为扫描电镜检测生物被膜与MPA检测结果相近，在检测生物被膜形成能力上具有良好的相关性。本研究中，164株SA流行株有141株呈MPA阳性，生物被膜形成率为86.0%，说明新疆地区奶牛源SA流行株具有普遍的生物被膜形成能力，且以弱生物被膜形成菌株为主。黄惟彬等（2015）从中山大学附属第三医院的患者临床标本中分离出33株SA，其生物被膜形成率为87.9%，以弱生物被膜形成菌株（54.5%）为主;Tiwari等（2018）檢测从患者化脓伤口处分离获得89株SA的生物被膜形成能力，结果发现菌株的生物被膜形成率为88.7%，以强生物被膜形成菌株（41.8%）为主。故推测生物被膜形成能力的差异源自宿主来源及分离样本差异。

本研究對164株奶牛源SA流行株的生物被膜形成相关基因分布进行PCR检测，结果发现clfA、clfB、fnbA、fnbB、cna、fib、icaA、icaC和icaD等9种基因检出率较高，且每株菌株至少同时携带4种生物被膜形成相关基因，与SA生物被膜形成高检出率间具有相关性。胞间多糖黏附素（PIA）在SA生物被膜成熟阶段发挥重要作用，其功能取决于3种膜蛋白编码基因（icaA、icaC和icaD）和1种细胞外蛋白（icaB）ica操纵子的表达水平（陈程等，2018;Neopane et al.，2018）。本研究结果显示，icaA基因在生物被膜形成能力不同菌株中的检出率为86.9%～92.1%;与无生物被膜形成的菌株相比，弱生物被膜和强生物被膜形成能力菌株的icaA基因表达量与之无明显差异;icaD基因检出率为100.0%，在强生物被膜形成菌株中的表达量显著高于弱生物被膜形成菌株。Götz（2010）研究表明，icaA基因单独作用具有低转移酶活性，当其与icaD基因共同表达时，转移酶活性可增加20倍，且icaD基因可能是指导icaA基因正确折叠和插入的分子伴侣。本研究也发现，icaD基因转录水平与生物被膜形成能力间呈正相关，说明icaD基因在SA生物被膜形成过程中发挥重要作用，与Atshan等（2013）认为icaC基因是ica基因家族在24 h内唯一高表达基因的结论不同，可能是由于ica基因主要介导生物被膜的初始定植阶段（Vandecasteele et al.，2003）。

目前，SA生物被膜形成的分子机制尚未清楚。MSCRAMM可帮助细菌附着在宿主表面，且在适当条件下与PIA/PNAG配合而介导细胞间黏附（O’Gara，2007），与ica非依赖的生物被膜形成具有相关性（Otto，2013）。本研究结果表明，6种MSCRAMM基因家族成员（clfA、clfB、fnbA、fnbB、cna和fib基因）的检出率总体上较高（61.5%～82.9%），其中，clfB、fnbA和fib基因以无生物被膜形成菌株的检出率最高，但在中等和强生物被膜形成能力菌株中的检出率较低;fnbA和fnbB基因在强生物被膜形成菌株中的转录水平显著上调。李丽等（2011）曾对137株奶牛乳腺炎葡萄球菌进行clfA、clfB、fnbA和fnbB基因分布检测，结果显示这些基因在生物被膜阳性和阴性菌株中的分布差异不明显，且对生物被膜形成的影响不明显。该结论与本研究结果存在差异，可能是李丽等（2011）未对葡萄球菌进行细化且未对基因转录水平进行深入研究。此外，O’Neill等（2007，2009）研究表明fnbA和fnbB基因介导的生物被膜形成在耐甲氧西林SA中扮演重要角色。本研究也发现，fnbA、fnbB、clfA和fib基因在生物被膜强阳性菌株中的转录水平较高，提示这些基因在SA生物被膜形成过程中发挥重要作用;而fnbA和fib基因在生物被膜强阳性菌株中携带率低，且部分菌株虽然携带生物被膜形成相关基因但缺乏具体表型，可能与生物被膜复杂的形成机制有关，具体原因有待进一步探究。

4 结论

新疆地区奶牛源SA流行株生物被膜形成率高，生物被膜形成相关基因携带率也较高，其中icaA、icaD、fnbA、fnbB、clfA和fib基因与SA生物被膜的形成密切相关。

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（責任编辑 兰宗宝）