高效液相色谱法测定知柏地黄丸中马钱苷及菝葜皂苷元的含量

刘海兰 骆桂法 张巍云

摘要 目的：通過高效液相色谱法测定知柏地黄丸中有效成分马钱苷及菝葜皂苷元的含量。方法：选取高效液相色谱法对知柏地黄丸中成分的含量进行测定。色谱条件采用C18色谱柱（型号为Eclipse XDB），该色谱柱的长度为250 mm，色谱柱内经为4.6 mm，色谱柱填料颗粒直径为5 μm。进样量为20 μL，流动相采用乙腈（A相）和0.1%磷酸水溶液（B相）的二元体系进行梯度洗脱。高效液相色谱法（HPLC）严谨性考察，包括线性关系、精密度、重复性、稳定性和加样回收试验考察，结果：阴性对照品溶液1在与马钱苷对照品溶液和供试品溶液色谱图相同时间处未见相同色谱峰;阴性对照品2在与菝葜皂苷元对照品溶液和供试品溶液色谱图相同时间处未见相同色谱峰。线性考察结果显示回归方程、相关系数和线性范围分别是：马钱苷在0.040 54～4.054 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，其回归方程为Y=611.16X+5 664.1（r=0.999 7）;菝葜皂苷元进样量在0.440 01～4.353 μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系，回归方程Y=1.639 7X+11.549（r=0.999 8）。精密度试验：RSD=0.79%;稳定性试验：色谱峰相对峰面积RSD平均值1.716%;重复性试验：色谱峰相对峰面积RSD平均值2.011%。马钱苷对照品溶液、菝葜皂苷元对照品溶液平均回收率分别为105.719%、98.865%，RSD分别为1.29%、1.36%。201805026、201806013、201807085等3个不同批次号的知柏地黄丸中，马钱苷成分和菝葜皂苷元成分的含量差异无统计学意义。结论：高效液相色谱法的操作简单，结果具有较好的精密度、稳定性和重复性，可作为知柏地黄丸质量控制的有效方法，而不同批次知柏地黄丸中有效成分含量未见明显差异。

关键词 高效液相色谱法;知柏地黄丸;马钱苷;菝葜皂苷元;精密度;稳定性;重复性;专属性

Abstract Objective：To determine the content of loganin and sarsasapogenin in Zhibai Dihuang Pills by HPLC.Methods：The chromatographic conditions were determined by C18 column（type Eclipse XDB）.The length of the column was 250 mm，the diameter of the packing particles in the column was 5 micron，and the inner diameter of the column was 4.6 mm.A binary system of acetonitrile（A phase）and 0.1% phosphoric acid aqueous solution（B phase）was used for gradient elution.The method of high performance liquid chromatography（HPLC）was rigorous，including linear relationship，precision，repeatability，stability and sample recovery test.Based on the rigorous premise of HPLC，the content of Zhibai Dihuang Pills was determined.Results：1）Negative reference solution 1 did not show the same chromatographic peak at the same time as loganin reference solution and test solution，while negative reference solution 2 did not show the same chromatographic peak at the same time as sarsasapogenin reference solution and test solution.The results showed that loganin and sarsapogenin had good specificity. 2）Linear regression equation，correlation coefficient and linear range were：loganin had good linear relationship with peak area in the range of 0.040 54～4.054 μg，and the regression equation was Y=611.16X+5 664.1（r=0.999 7）; sarsapogenin injection was 0.44 ugh，and the regression equation Y=1.639 7X+11.549（r=0.999 8）was obtained. 3）The precision test showed that the RSD was 0.79%.The stability test showed that the RSD average value of the relative peak area was 1.716%.It indicated that the stability of Zhibai Dihuang Pills was good within 24 hours.The value was 2.011%，indicating that the solution of Zhibai Dihuang Pills had good reproducibility. 4）The results showed that the average recoveries of loganin and sarsapogenin were 105.719% and 98.865% and RSD were 1.29% and 1.36% respectively，suggesting that the high-phase liquid phase detection method was reliable. 5）The contents of strychnine and sarsapogenin in Zhibai Dihuang Pills of different batches，such as 201805026，201806013 and 201807085，were not significantly different.Conclusion：The HPLC method is simple，accurate，stable and reproducible.It can be used as an effective method for quality control of Zhibai Dihuang Pills.There was no significant difference in the content of active ingredients in different batches of Zhibai Dihuang Pills.

Key Words High performance liquid chromatography; Zhibai Dihuang Pills; Loganin; Sarsapogenin; Precision; Stability; Repeatability; Specificity

中图分类号：R289.4;R2847文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.08.014

知柏地黄丸是由中药知母、黄柏、熟地黄、山药、山茱萸（制）、牡丹皮、茯苓、泽泻，以蜂蜜为辅料制作而成的中成药，知柏地黄丸出自《医宗金鉴》，是在六味地黄丸的基础上加了知母和黄柏两味药，全方共奏滋肝脾肾阴，清相火泄湿浊之效[1]。根据《药性论》所述山茱萸曰：“止月水不定，补肾气，兴阳道，添精髓，疗耳鸣，止老人尿不节”。即山茱萸具有补益肝肾，涩精固脱的功效，临床主要用于遗尿[1]、崩漏[1-2]、阳痿[1，3-4]等病证;山茱萸的主要成分含有马钱苷，药理学研究发现，马钱苷能有效增强小鼠的抗疲劳能力和提高小鼠的记忆力等[5-6]。根据《用药法象》所描述知母曰：“泻无根之肾火，疗有汗之骨蒸，止虚劳之热，滋化源之阴”。即知母具有清热泻火、生津润燥之功，用于骨蒸潮热和内热消渴疗效奇佳，现代药理学显示，知母的主要成分之一为菝葜皂苷元[7-8]。有研究发现，菝葜皂苷元能有效改善骨质疏松，同时能够上调超氧化物气化酶的表达水平，增强大鼠的抗氧化能力[9-10]。尽管知柏地黄丸在临床上已经使用多年，且疗效良好，但是对其药物的有效成分进行定量分析的研究仍较少，未能有效建立一种中药质量评定方法，不利于本品的产品质量控制。高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是目前在中药成分研究领域中最为广泛使用的分析方法之一，其具有应用范围广、检测分析快、药物分离、检出灵敏度高、操作自动简便等优点[11-12]，本研究使用HPLC对知柏地黄丸中马钱苷和菝葜皂苷元这2个成分含量进行测定。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent高效液相（型号：1200型），其中该色谱系统还包括以下主要适配零件和系统，如二极管阵列DAD检测器（型号：G1315D型）、四元梯度泵（型号：G1311A型）、柱温箱（型号：G1316A型）、在线脱气机和化学工作站（型号：G1322A型）。购买于上海精密仪器仪表公司的电子分析天平（型号：FA1004N型）和超声波清洗器（型号：KQ-100DE）;购买于法国MILIPORE公司的超纯水系统（型号：Mili-RO Plus型）;上海科导超声仪器有限公司;双光束紫外可见分光光度计（型号：MQK-UV1800型）购买于上海米青科实业有限公司。

1.2 试药 于中国药品生物制品检定所购买马钱苷对照品和菝葜皂苷元对照品，批号分别为11640-200502、11074-20041。于美国Fisher公司购买色谱纯乙腈和甲醇，批号分别为：102489、101437。于上海拓国沪试实验室器材股份有限公司购买的磷酸分析纯（AR级，批号：20170412）。

1.3 分析药品 知柏地黄丸（由九芝堂股份有限公司，国药准字Z11020152），选择201805026、201806013、201807085等3个不同批次。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用C18色谱柱（型号为Eclipse XDB），该色谱柱的长度为250 mm，色谱柱内经为4.6 mm，色谱柱填料颗粒直径为5 μm，柱温25 ℃。进样量为20 μL，流动相采用乙腈（A相）和0.1%磷酸水溶液（B相）的二元体系进行梯度洗脱，具体的梯度洗脱程序和流速见表1。

2.2 对照品溶液的配制 精密称取马钱苷对照品，加80%甲醇制成每毫升含马钱苷30 μg的溶液，即得马钱苷对照品溶液。精密称取菝葜皂苷元对照品适量，加甲醇制成每1.0 mL含0.2 mg的溶液，即得菝葜皂苷元对照品溶液。混合对照品即取适量菝葜皂苷元对照品溶液和马钱苷对照品溶液混合均匀即得。

2.3 供试品溶液的配制 精密称定知柏地黄丸1 g，置于具塞锥形瓶中，用量筒精密加入乙醇20 mL，称定重量并记录，浸泡过夜。超声处理（功率250 W，频率30 kHz）20 min，待冷却后称定重量并记录，用乙醇补足重量差，摇匀，取滤过液待用。精密量取滤过液10 mL，蒸干，加水和盐酸分别为10 mL、1 mL，采用加热回流法2 h后关火，取出冷却至25 ℃，一边滴加40%氢氧化钠溶液一边均匀振摇充分混合，至溶液颜色由橙黄突变为橙红停止滴加40%氢氧化钠溶液;在此基础上用三氯甲烷振摇提取2次，30 mL/次，合并2次三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取过滤液，即得知柏地黄丸供试品溶液。阴性对照品溶液1，知柏地黄丸去山茱萸后同供试品溶液提取方法即得;阴性对照品溶液2，知柏地黄丸去知母后同供试品溶液提取方法即得。

2.4 专属性试验 取20 μL马钱苷对照品溶液、菝葜皂苷元对照品溶液、供试品溶液和各自对应的阴性对照品溶液，根据2.1的色谱条件进行专属性试验，结果显示阴性对照品溶液1在与马钱苷对照品溶液和供试品溶液色谱图相同时间处未见相同色谱峰;阴性对照品2在与菝葜皂苷元对照品溶液和供试品溶液色谱图相同时间处未见相同色谱峰。提示马钱苷和菝葜皂苷元具有良好的专属性。见图1。

2.5 线性关系考察 精密称取马钱苷对照品10.14 mg，放置25 mL量瓶中，加入80%甲醇溶解并稀释至刻度定容，即得含马钱苷0.405 3 mg/mL的马钱苷对照品溶液，分别精密吸取2、3、5、10、20 μL，按照“2.1”项下色谱方法进样。以峰面积积分值（Y）的自然对数为纵坐标，以进样量的自然对数（X）为横坐标，进行线性回归。结果表明，马钱苷在0.040 54～4.054 μg范围内与峰面积良好的线性关系，其回归方程为Y=611.16X+566 4.1（r=0.999 7）。精密量取浓度为0.217 3 mg/mL的菝葜皂苷元对照品溶液适量，同马钱苷线性回归方法，得回归方程Y=1.639 7X+11.549（r=0.999 8）。结果表明，菝葜皂苷元进样量在0.440 01～4.353 μg范圍内与峰面积积分值呈良好的线性关系。见表2。

2.6 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液，在一组相同的测量程序、相同测试地点和相同的色谱条件等情况下，连续进样6次，进样20 μL/次。结果显示，RSD=0.79%，表明高效液相仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验 由于固定相的有限稳定性，为确保每一次研究之间的结果误差最小，进行指纹图谱对比研究之前，取同一批号供试品溶液以确定供试品溶液的稳定性，分别室温放置0、4、8、12、24 h后进行HPLC检测，各色谱峰相对峰面积的RSD<3%则说明稳定性良好，本研究稳定性结果显示色谱峰相对峰面积RSD平均值1.716%，提示知柏地黄丸供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验 为确保研究的客观性，进行指纹图谱对比研究之前，需要进行短时间内的HPLC连续重复性测试，精密量取6份同一批号供试品溶液，进样量20 μL，连续进样，各色谱峰相对峰面积的RSD<3%表示重复性良好，本研究结果显示色谱峰相对峰面积RSD平均值2.011%，提示知柏地黄丸供试品溶液的重复性良好。见表3。

2.9 回收率试验 精密吸取已知含量的知柏地黄丸供试品溶液6份，均为1 mL/份，分别置于10 mL容量瓶中，每一份均精密加入等量已知浓度的0.405 3 mg/mL马钱苷对照品溶液、0.217 3 mg/mL菝葜皂苷元对照品溶液，加入超纯水稀释至刻度定容混合均匀后，进行加样回收试验的检测，根据2.1的色谱条件进行检测并计算加样回收率。结果显示马钱苷对照品溶液、菝葜皂苷元对照品溶液平均回收率分别为105.719%、98.865%，RSD分别为1.29%、1.36%，提示高相液相检测方法所测加样回收率结果可靠。见表4。

2.10 样品检测结果

取201805026、201806013、201807085等3个不同批次号的知柏地黄丸，根据2.2供试品溶液配制，每批样品都根据2.1的色谱条件进行重复测试3次，知柏地黄丸中成分的含量取3次测定的平均值，结果显示，3个不同批次的知柏地黄丸中马钱苷成分和菝葜皂苷元成分的含量未见明显差异。见表5。

3 讨论

知柏地黄丸出自于清代吴谦·《医宗金鉴》，另据李明权考证，知柏地黄丸最早是以“滋阴八味丸”的名称出现于明代张介宾所著的《景岳全书·新方八阵》。知柏地黄丸为《中华人民共和国药典》2015年版1部收载品种，是滋阴清热的经典名方，应用广泛，对阴虚火旺型糖尿病、老年干燥症、女性更年期综合征、肾病综合征等均具有良好的治疗效果。近年来经中医辨证后灵活使用，对慢性咽炎、急性尿路感染等疾病也有较好疗效。利用现代药理学研究方法建立阴虚模型对其细胞水平和分子水平的药理作用机制研究也证明了其治疗阴虚的作用。知柏地黄丸中的君药为知母，而知母有效成分为多种甾体皂苷，其皂苷主要为菝葜皂苷元。知母根茎中含甾体皂苷约为6%[14]，有知母皂苷A1、A2、A3、A4、B1、B2等。菝葜皂苷元为知母中几种主要甾体皂苷的母核皂苷元，因此，可通过测定菝葜皂苷元的含量对知母药材的质量进行控制，进而有效、准确地控制知柏地黄丸的质量。

山茱萸是知柏地黄丸中关键的臣药之一，目前有关山茱萸含量测定方法的研究颇多，主要是以熊果酸、齐墩果酸和马钱苷等为含量检测指标。山茱萸中熊果酸含量测定的文献报道虽比较多，但熊果酸并非山茱萸的特有成分，它存在于山楂、马鞭草、车前草、紫珠、女贞子、怀牛膝等许多药材中，并且熊果酸与齐墩果酸均属三萜酸，这2种成分在天然植物中又是共生共存的，在化学结构上是差向异构体，两者的极性也几乎无差别[15]。有实验表明，在薄层板上应用《中华人民共和国药典》条件无法分离开，实验中所测得实际熊果酸含量其实是熊果酸与齐墩果酸含量的总和[16-17]。马钱苷为山茱萸主要有效成分，测定其含量，可为山茱萸及其制剂提供质量控制的有效手段。在提取方法的选择上，以马钱苷和菝葜皂苷元含量作为考察指标，对提取溶剂进行考察：取样品1 g 3份，分别精密加入甲醇，80%甲醇，50%甲醇25 mL，超声30 min。用80%甲醇提取的含量较高，所以选用80%甲醇作为提取溶剂。对提取方式及时间进行考察：取样品1 g 6份，精密加入80%甲醇25 mL，取其中3份回流，提取时间分别为20，30，40 min;取另外3份超声，提取时间分别为20，30，40 min。回流和超声2种提取方式对含量结果影响不大，因超声操作较为简便，且20 min能将马钱苷和菝葜皂苷元提取完全，故选择超声处理（功率250 W，频率49 kHz）20 min。

综上所述，采用高效液相色谱法操作简便，结果准确，重复性好，加样回收率高，可用于知柏地黄丸的质量控制。在对具有多种有效成分，且相互间可发生直接影响的知柏地黄丸来说，检测药物有效成分是，单一的对一种成分或少数几个有效成分进行检测，仍不足以较为全面地体现出知柏地黄丸的质量控制效果，故而未来将进一步结合检测多种有效成分，更全面反映知柏地黄丸的质量评价，以期为知柏地黄丸的质量控制及药理研究工作提供相关思路。

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（2018-10-29收稿 责任编辑：杨觉雄）