不同等级白牡丹茶游离氨基酸构成分析

陈思肜 赵峰 王淑燕 金珊 周鹏 危赛明 叶乃兴

摘 要：【目的】通过对不同等级白牡丹茶游离氨基酸的分析，探究氨基酸种类与白牡丹茶品质等级的关系。【方法】采用AQC柱前衍生结合超高效液相色谱-串联质谱法 （UHPLC-MS/MS）测定游离氨基酸后，通过结合偏最小二乘法判别分析法 （Partial least squares discrimination analysis， PLS-DA）和聚类分析法，对9批次不同等级白牡丹茶的35种游离氨基酸进行分析。【结果】白牡丹茶中除β-氨基丁酸、同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸5种氨基酸外，其余30种氨基酸均高于定量限。相关分析结果显示，游离氨基酸与白牡丹品质等级间存在密切相关性;其中，γ-氨基丁酸、丝氨酸、脯氨酸、色氨酸、甘氨酸对于白牡丹茶滋味品质的影响最大;味觉分析结果显示，γ-氨基丁酸对白牡丹茶滋味的收敛性有重要贡献，而其余氨基酸主要通过交互作用对白牡丹茶滋味品质产生贡献。【结论】白牡丹茶的游离氨基酸构成与其品质等级间存在密切相关性，不同氨基酸组分通过交互作用对白牡丹茶的滋味等级形成产生整体性的贡献作用。

关键词：白茶;白牡丹;游离氨基酸组分;滋味;品质等级

中图分类号：TS 272文献标识码：A文章编号：1008-0384（2019）08-965-09

Abstract：【Objective】 The amino acids in white peony teas of various quality grades were compared. 【Method】 Free amino acid compositions of 9 white peony tea specimens were determined using AQC pre-column derivatization combined with the ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UHPLC-MS/MS）. The analytical results on 35 amino acids were compared for the study by the partial least squares discrimination analysis （PLS-DA） and cluster analysis. 【Result】Aside from β-aminobutyric acid， homocysteine， cysteine， cystine， and tyrosine， the remaining 30 amino acids in the tea samples showed higher contents than the limit of quantitation. The correlation analysis on the data indicated a significant correlation between the amino acid composition and the quality of the teas. For instance， γ-aminobutyric acid， serine， proline， tryptophan， and glycine significantly affected the taste， while γ-aminobutyric acid was crucial on the astringency， of the brewed tea as shown in a taste test. The other amino acids appeared to interactively contribute to the sensory quality. 【Conclusion】 Either individually or interactively， free amino acids had a significant effect on the taste， therefore， the grading of the white peony teas.

Key words：white tea; white peony; free amino acid composition; taste; quality grade

0 引言

【研究意義】白茶是六大茶类之一，2016年全国白茶的总产量达到2.25万t，产值约为22.5亿元[1-2]。福建福鼎、政和、建阳、松溪是白茶的主要产地。白茶的游离氨基酸含量高于其他茶类，氨基酸不但对茶汤的鲜爽滋味有重要作用，其组成还与茶叶保健功效密切相关[3-4]。根据加工原料嫩度及品种的差异，传统白茶主要分为白毫银针、白牡丹、贡眉和寿眉等4个品类[5]，其中以白牡丹的产量最高。【前人研究进展】游离氨基酸含量和构成比例对茶叶品质有重要贡献[6-7]。白茶中游离氨基酸总量显著高于其他茶类;绿茶和红茶的游离氨基酸总量间未见显著差异;而乌龙茶和黑茶的游离氨基酸总量则相对较低[8]。不同茶类游离氨基酸的构成对其品质的影响也不尽相同，并由此形成了不同品类茶叶的风味差别[9]。例如：绿茶的等级与茶氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸含量密切相关[10-12];而红茶的品质主要受丝氨酸、苯丙氨酸的影响[13];除茶氨酸外，乌龙茶中谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸和亮氨酸含量较高[14-15];黑茶中茶氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、蛋氨酸含量与原料老嫩程度密切相关[16];茶氨酸、甘氨酸、脯氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丙氨酸对白茶鲜甜风味存在贡献[17]。【本研究切入点】目前，多数对茶叶游离氨基酸组分的研究主要集中在不同茶类或种质资源上，并且仅局限于20种蛋白质氨基酸和茶氨酸，而对于含量相对较低的非蛋白质氨基酸关注较少，对于同一品类不同等级茶叶游离氨基酸组分开展的细致研究则更为鲜见。【拟解决的关键问题】本研究通过AQC柱前衍生结合超高效液相色谱-串联质谱系统 （UHPLC-MS/MS），对不同等级白牡丹茶中20种蛋白质氨基酸和15种非蛋白质氨基酸进行定量，并由此探究游离氨基酸构成与白牡丹茶品质等级间的相关性，为白牡丹茶滋味构成及品质评价提供基础性参考。

1 材料与方法

1.1 试剂

色谱级甲醇、乙腈 （Sigma公司，美国）;AccQ·FluorTM氨基酸衍生试剂盒 （Waters公司，美国）;试剂级甲酸铵 （J&K Scientific公司，中国）。

氨基酸标准储备液A（Sigma公司，美国）：含5 nmol·mL-1的丙氨酸 （44.5 mg·L-1）、L-2-氨基己二酸 （80.6 mg·L-1）、α-氨基丁酸 （51.6 mg·L-1）、β-氨基丁酸 （51.6 mg·L-1）、γ-氨基丁酸 （51.6 mg·L-1）、精氨酸 （87.1 mg·L-1）、天冬氨酸 （66.6 mg·L-1）、瓜氨酸 （87.6 mg·L-1）、羟脯氨酸 （65.6 mg·L-1）、胱氨酸 （120.2 mg·L-1）、谷氨酸 （73.6 mg·L-1）、甘氨酸 （37.5 mg·L-1）、组氨酸 （77.6 mg·L-1）、同型半胱氨酸 （134.2 mg·L-1）、羟赖氨酸 （81.1 mg·L-1）、异亮氨酸 （65.6 mg·L-1）、亮氨酸 （65.6 mg·L-1）、赖氨酸 （73.1 mg·L-1）、蛋氨酸 （74.6 mg·L-1）、1-甲基-L-组氨酸 （84.6 mg·L-1）、3-甲基-L-组氨酸 （84.6 mg·L-1）、鸟氨酸 （66.1 mg·L-1）、苯丙氨酸 （82.6 mg·L-1）、脯氨酸 （57.6 mg·L-1）、肌氨酸 （44.5 mg·L-1）、丝氨酸 （52.6 mg·L-1）、苏氨酸 （59.6 mg·L-1）、色氨酸 （102.1 mg·L-1）、酪氨酸 （90.6 mg·L-1）、缬氨酸 （58.6 mg·L-1）。

氨基酸标准储备液B（华培贸易公司和索莱宝科技有限公司，中国）：分别称取豆叶氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、茶氨酸、谷氨酰胺，各20 mg，以0.02 mol·L-1盐酸定容至10 mL，得浓度为2 000.0 mg·L-1的B标准储备液。

氨基酸混合标准储备液：分别移取2.00 mL氨基酸标准储备液A和0.50 mL储备液B，以0.02 mol·L-1盐酸定容至10 mL。

1.2 供试样品

产自2018年的特级 （A）、一级 （B）和二級 （C）白牡丹商品茶样各3批次，茶样原料为福鼎大毫茶，分别由福鼎宝鼎茶业有限公司 （A1， B1）、福鼎茶博论茶业有限公司 （A2，C1）、福鼎卓掌柜茶业有限公司（B2，C2）、福鼎沐云山茶业有限公司（A3，C3）、福鼎高山香白牡丹产业城有限公司（B3）提供。

1.3 氨基酸定量分析

参照ZhouPeng[18]的方法，以AQC试剂衍生后，以UPLC 1290 Infinity色谱串联6490 Triple Quad质谱 （Agilent公司，美国）进行分析，各化合物的分子量、母离子、子离子如表1所示。具体过程如下：称取粉碎茶样0.20 g，加40 mL纯水并涡旋混合 （上海芃奇科学仪器有限公司，中国），45 kHz室温下超声提取（昆山市超声仪器有限公司，中国）30 min后，离心 （×10， 000 g， 4℃，5 min） （Eppendorf，德国）;取10 μL经0.22 μm微孔滤膜过滤的上清液与70 μL AccQ-Fluor硼酸盐缓冲液 （pH=8.8）混合，加AccQ-Fluor试剂 （3 000 mg·L-1） 20 μL，涡旋后，置55℃烘箱中10 min，冷却待用。

使用UPLC 1290 Infinity色谱串联6490 Triple Quad质谱 （Agilent公司，美国）对35种氨基酸进行定量分析，质谱数据采集分析通过Mass Hunter （Version 5.0， Agilent公司，美国）完成。采用GB/T 8304-2013测定样品水分含量，氨基酸的定量结果以干基计。

1.4 数据处理

通过PASW 20.0软件 （SPSS Statistics，IBM公司，美国）对样品氨基酸结果进行统计和单因素方法分析 （Oneway-ANOVA）。对氨基酸定量结果，进行标准化后，计算公式如下：标准化结果以Heml 1.0（Heatmap Illustrator， The CUCKOO Workgroup， 中国）绘制heatmap。采用Simca-P 11.5软件 （Umetrics AB， Umea公司，瑞典）进行偏最小二乘法判别分析 （PLS-DA）。

1.5 氨基酸的味觉活性分析

味觉活性值 （Dose-over-threshold， DoT），是指某一滋味成分浓度与其滋味阈值的比值，当DoT大于1时，可认为其对相应的滋味属性有极显著的贡献[19]。参照GB/T 23776-2018 茶叶感官审评方法，按茶水比 （3 g∶110 mL）换算对应的白牡丹样品茶汤中各种氨基酸的浓度，计算公式如下：各氨基酸浓度（mg·L-1），而后通过文献检索获得试验目标氨基酸的对应呈味阈值，以参试样品对应氨基酸的含量均值除以呈味阈值，计算得其DoT值。

2 结果与分析

2.1 不同等级白牡丹茶样品的游离氨基酸定量结果

9批次不同等级白牡丹氨基酸的定量结果如表2所示，35种氨基酸中，除β-氨基丁酸、同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸5种外，其余氨基酸的含量均高于定量限。为了对上述数据进行更直观的比较，将上述氨基酸定量结果进行标准化处理后绘制热图 （图1），将含量均值高于0.1 mg·g-1 DW的定义为白牡丹茶的常量氨基酸 （以红色方框表示，共包括18种），其余氨基酸定义为微量氨基酸 （以蓝色方框表示，共12种）。

由图1可以直观地发现白牡丹茶中的常量氨基酸的含量与样品等级间，呈现明显的线性相关性，即，高等级样品的常量氨基酸显著高于低等级样品;而微量氨基酸的含量与样品等级间则未见明显规律。主成分分析是一种可直观地反映样本组分构成的近似度的统计方法，样本间的相似度越高则距离越近。如图2-A所示，不同等级样品间呈现较好的聚集状态;其中，特级样品仅通过第一主成分就获得良好分离;而一级和二级样本的区分需要结合第二主成分才能得以实现;即，一级和二级样品间的差别较小，而与特级样品间则存在较大差异性。R2和Q2是主成分分析过程中，用于反映模型拟合度和预测准确率的参数，可知，该模型的第一、第二主成分的累积贡献方差为96.21%，预测准确率为73.25%，进一步地验证了该模型用于等级区分的有效性。如图2-B所示，高等级白牡丹茶中的氨基酸构成具有显著的多样性特征，共有17种氨基酸 （天冬氨酸、茶氨酸、精氨酸、γ-氨基丁酸、谷氨酰胺、色氨酸、丝氨酸、肌氨酸、脯氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、苏氨酸、亮氨酸、天冬酰胺）临近特级白牡丹的质心，即它们与特级白牡丹的品质密切相关。相比较而言，一级样品质心 （B）和二级样品质心 （C）附近所集中的氨基酸则较少。通过载荷矩阵图，可以进一步剖析各种类氨基酸对判别结果的贡献程度，当变量与等级质心距离近时，则说明该变量其对样品等级贡献度大。

2.2 不同等级白牡丹茶游离氨基酸组分的味觉活性分析

表3的统计结果呈现了不同等级白牡丹茶样品的氨基酸含量差异。不同等级间氨基酸总量存在显著性差异，并与等级呈现明显线性相关性，总量由高至低依次为：特级 （45.04±0.98）mg·g-1、一级 （37.92±0.88） mg·g-1、二级 （26.41±1.89） mg·g-1。具体到各种构成氨基酸而言，常量氨基酸中除丙氨酸在不同等级间不存在显著差异外，其余氨基酸均存在差异。其中，尤以茶氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、天冬氨酸、苏氨酸这5种氨基酸差异显著，含量越高则等级越高。从呈味上看，茶氨酸鲜爽带甜，谷氨酰胺、天冬氨酸鲜甜带酸，苏氨酸呈微甜味;精氨酸呈苦味。由此可推断，鲜甜味氨基酸对白茶的滋味等级间存在明显的正相关，而苦味氨基酸则与其等级间存在负相关。

统计分析结果还显示，特级白牡丹中的丝氨酸、脯氨酸、色氨酸、甘氨酸的含量显著高于其他等级，而它们在一级与二级样品间却不存在显著差异。从呈味上看，丝氨酸、脯氨酸、甘氨酸主要呈甜味;色氨酸则主要呈苦味。由此推断，上述氨基酸会对于白茶滋味品质的进一步提升有促进作用。

不同等级的白牡丹茶具有各自的滋味特征，特級白牡丹的滋味特征为清甜醇爽、毫味足;一级白牡丹的滋味则较清甜、醇爽;二级白牡丹的滋味为尚清甜、醇厚。为了进一步研究不同等级白牡丹种各种氨基酸对滋味的贡献，采用Dot值对滋味属性的贡献进行了量化分析，如表4所示，除对收敛性涩味有贡献的γ-氨基丁酸外，其余氨基酸的Dot值均小于1。而且γ-氨基丁酸在茶汤中的DoT值与样品等级呈现明显线性相关，由高至低依次为：特级 （15.43）、一级 （14.45）、二级 （11.70）。因此，我们认为γ-氨基丁酸是白牡丹茶汤收敛性又一个重要来源，对白牡丹茶滋味品质的形成起重要的促进作用。

3 讨论与结论

已有的研究肯定了氨基酸对茶叶鲜味贡献作用[10，12]，但Dot的分析结果却显示，茶叶中绝对含量高的氨基酸，往往因其呈味阈值较高，基本都无法独立地形成主要滋味属性，故而笔者推测不同氨基酸组分间存在交互作用，进而以一种整体性的累积方式，对茶叶滋味，特别是鲜味的形成有贡献作用。例如，茶叶中的茶氨酸，虽然呈味阈值较高，但是它是一种典型的鲜味增强剂，在与其他氨基酸共同存在时，会显著降低其他氨基酸的呈味阈值;而茶叶中的谷氨酸可以显著降低 EGCG 苦味的作用。茶氨酸和谷氨酸在茶汤苦味和鲜味的形成上具有明显的交互和协同效应。此外，近年的研究还发现，茶叶中甘氨酸和脯氨酸对茶汤鲜味有协同增效作用[19，21-22]。因此，笔者认为白牡丹中游离氨基酸组分的比例关系对等级存在影响。

氨基酸含量可促进名茶香气鲜爽风味和茶汤鲜醇滋味的形成[23]。白牡丹中游离氨基酸的总量、常量氨基酸含量的高低与白牡丹品质等级间存在密切相关性，其中茶氨酸、精氨酸、天冬氨酸、苏氨酸这4种氨基酸的绝对含量与白牡丹品质等级的紧密相关。这与陈丹等[13，24]对云南红碎茶、永川秀芽茶的研究结果表明氨基酸总量随茶叶品质等级依次递减及阮宇成等[11]的研究结果表明茶氨酸、天冬氨酸、精氨酸的含量与绿茶品质呈极显著正相关相同。

张丹丹等[17]的研究结果显示茶氨酸、脯氨酸、甘氨酸、脯氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丙氨酸是对白茶的甜味存在贡献物质，其中谷氨酸还同时对白茶鲜味有贡献。杨晨[20]的研究结果显示白茶中除了γ-氨基丁酸外，其余氨基酸的浓度都远低于其呈味阈值。本研究结果显示，γ-氨基丁酸、丝氨酸、脯氨酸、色氨酸、甘氨酸的含量对于白牡丹茶滋味品质的提升有关键性作用。其中γ-氨基丁酸的DoT值与样品等级呈现明显线性相关，是白牡丹茶汤收敛性的主要来源，其余氨基酸都无法独立呈现其滋味属性，氨基酸对白牡丹鲜甜滋味的贡献应该是多种氨基酸的整体作用的结果，与前人结论相符。

本研究涉及的3个等级白牡丹茶的游离氨基酸构成与其品质等级间存在密切相关性，不同氨基酸组分通过交互作用对白牡丹茶的滋味等级形成产生整体性的贡献作用。可为白牡丹茶滋味构成及品质等级的科学评价提供基础性参考。

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（责任编辑：黄爱萍）