建阳桔柚两种真菌病原菌的鉴定

葛慈斌 黄素芳 阮传清 肖荣凤 刘韬

摘 要：【目的】明确引起福建建阳桔柚落叶、枝梢枯死的两种病害的病原菌种类，为防治病害提供基础。【方法】从建阳桔柚上采集典型发病叶片，进行病原菌的分离、形态观察和菌株rDNA-ITS 区序列比对、致病性测定。【结果】桔柚病叶片中分离出两种主要病原真菌，代表菌株分别为FJAT-32214和FJAT-32151。菌株FJAT-32214在PSA培养基上的菌落颜色为灰褐色，产褐色分生孢子，多呈链状分隔，其rDNA-ITS区序列与互隔交链孢霉Alternaria alternata的ITS序列相似性达99%;菌株FJAT-32151在PSA培养基平板上的菌丝呈灰白色，绒状、茂密，后期会在菌落表面产生砖红色孢子堆，分生孢子柱形或棒状，单胞，无色， 其rDNA-ITS区序列与胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides 的ITS序列相似性也达99%，通过回接可引起样本致病，分离获得与接种物一致的病原物，符合Koch氏法则。【结论】通过病原形态学与ITS序列分析，鉴定了发生在建阳桔柚叶片上的两种主要真菌性病原，分别为引起褐斑病的互隔交链孢霉和炭疽病的胶孢炭疽菌。

关键词： 建阳桔柚;病害鉴定;互隔交链孢霉;胶孢炭疽菌

中图分类号：S 687文献标识码：A文章编号：1008-0384（2019）08-958-07

Abstract：【Objective】 To identify the pathogens of the severe defoliation and dieback diseases on Jianyang tangelos. 【Method】 Leaf specimens were collected from the diseased tangelo plants in Jianyang city. Microbial strains were isolated for morphological observation， pathogenicity determination， and sequence analysis on internal transcribed spacer （ITS） of ribosomal DNA for taxonomic identification. 【Result】 Separately， two strains were considered the pathogens for the diseases. The FJAT-32214 strain formed grayish brown colonies on a PSA medium and produced brown septate spores. Its rDNA-ITS sequences showed a 99% similarity with that of Alternaria alternata from NCBI. The other strain， FJAT-32151， formed on PSA gray-white， velvety， dense colonies with brick-red spore piles on the surface in late stage and produced columnar or rod-like， unicellular， colorless spores. The rDNA-ITS sequence of FJAT-32151 was 99% homologous with that of Colletotrichum gloeosporioides. Each of these isolated strains met Koch requirement with a challenge test by inoculation on healthy plants to show the typical morphological characteristics of the respective fungal disease. 【Conclusion】 It was confirmed that A. alternata was the pathogen that caused the brown spots disease， and C. gloeosporioides the anthracnose disease on the tangelos.

Key words：Jianyang tangelo; disease diagnosis; Alternaria alternata; Colletotrichum gloeosporioides

0 引言

【研究意義】建阳桔柚是由福建省建阳市农业开发公司于20世纪80～90年代在从日本引进的甜春桔柚基础上，通过优良变异单株选育而成的杂柑类品种[1]，是建阳市具有地方特色的名优水果和主要经济作物，于2009年11月获国家地理标志产品保护。建阳桔柚果大质优，既有桔子的清香，又具柚子的脆甜，色泽金黄、汁多肉脆、清香爽口[2]，是医药、食品工业的重要原料;其果实性凉味甘，有生津止咳、润肺化痰、理气健胃、散结止痛、醒酒利尿等多种功效，在省内外享有声誉。为了提高建阳桔柚的产量和品质，生产满足人们需求的绿色果品，必须辅以良好的配套栽培管理技术，其中做好病害防治管理是关键;而明确各种病害的病原菌，是进行病害防治的重要基础。

【前人研究进展】目前国内外关于桔柚，特别是建阳桔柚主要病害的研究报道较少，仅有叶新[3]报道建阳桔柚病害主要是溃疡病和炭疽病，其中炭疽病为害严重;刘韬等[4]也认为，急性炭疽病是建阳桔柚的主要病害;也有部分建阳桔柚会被柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus， CTV）侵染而发生衰退病[5]。对柑橘真菌病害的研究报道较多，主要集中在柑橘疮痂病Elsino fawcettii[6]、炭疽病Colletotrichum gloeosporioides[7]、树脂病Diaporthe sp.[8]、脚腐病Phytophthora parasitica[9]、黑斑病Phoma citricarpa[10]、煤烟病Capnodium citri[11]和灰霉病Botrytis cinerea[12]等。对作物病害的诊断方法，一般是田间实地观察植株的发病症状，再加上对病菌的分离培养和形态学鉴定等，这需要有较丰富的病害诊断经验，否则容易出现误诊。但现代分子生物学手段和特异性引物PCR扩增等技术的应用，为病害诊断提供了辅助措施，提高了病害诊断的准确率。

【本研究切入点】目前为止，有关建阳桔柚生产过程中发生的褐斑病、炭疽病等病害还未见详细的诊断报道，影响了对两种病害的及时防治，进而影响到建阳桔柚产业的健康发展。【拟解决的关键问题】本研究调查、鉴定建阳桔柚上发生的两种主要真菌性病害的病原菌，在病害症状与病原形态特征观察的基础上，利用分子鉴定方法进一步分析确认。

1 材料与方法1.1

试验材料

1.1.1 试验地点 试验地点为位于福建省南平市建阳区宋慈桔柚果场。

1.1.2 试验试剂、仪器 病原菌培养采用马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA），真菌基因组DNA提取试剂盒为DP2032，Taq酶（2.5 U·μL-1）[铂尚（上海）生物技术有限公司]，100 bp Marker（上海英骏生物技术有限公司）;真菌样品研磨仪为MP FastPrep-24（美国），凝胶成像仪（VP GelDoc-It TS Imaging System），PCR仪（Tpersonal Biometra）;引物合成由铂尚生物技术（上海）有限公司完成。

1.2 试验方法

1.2.1 症状观察

2018-2019年观察建阳桔柚树的发病情况，并在开花期、结果期和果实成熟期进行病害调查，并于2019年4月23日从建阳桔柚树的上部枝条中采集带有典型病斑的发病叶片。病害症状以肉眼观察为主，结合显微镜检查进行观察描述[13]。

1.2.2 病原真菌的分离、培养和观察

采用常规的组织分离法对发病叶片进行病菌的分离[14]。切取病健交界处的新鲜组织0.5 cm×0.3 cm大小的薄片，经75%酒精处理2 s，再用0.1%升汞处理2～3 min后，用无菌水清洗3遍，置于马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）上培养，每皿放5片病组织，共分离10个样本，（25.0±1.5）℃培养96 h，从典型菌落边缘挑取菌丝，接种在新的PSA平板上，直至获得分离物的纯培养，再转入试管斜面4℃保存和-80℃甘油保存。

将获得纯培养的分离物在光学显微镜下观察、记录其菌丝、分生孢子和分生孢子梗的形态、大小及色泽特征，并拍照。

1.2.3 病原真菌的分子鉴定

（1）菌丝DNA的提取：

接种菌株至PSA培养基平板，7 d后从平板上刮取菌丝约50 mg，放置于样品收集管中（含石英砂与玻璃珠），采用真菌基因组DNA试剂盒提取各菌株的基因组DNA。含菌丝体的收集管加入预热缓冲液FP1后，用样品研磨仪（型号美国MP FastPrep-24）40 s研磨2次，具体步骤参照试剂盒的提取说明。

（2） rDNA-ITS区扩增： 采用真菌ITS扩增通用引物进行扩增，正向引物（ITS4）：5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′，反向引物（ITS5）：5′-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3′PCR反应的总体积为25 μL，含有1个单位的Taq酶、10×buffer 2.5 μL、dNTP 0.2 μL、10 μmol·L-1的正向引物和反向引物各1 μL、DNA模板25 ng。PCR扩增程序：94℃预变性10 min，94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，共25个循环，最后72℃延伸10 min。

（3） PCR产物的测序及比对分析：

PCR产物经电泳检测后，送交铂尚生物技术（上海）有限公司进行测序。将测得的序列在GenBank注册、获得登录号，在网站NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）和CBS-KNAW（http：//www.westerdijkinstitute.nl）中进行同源性比对分析;并选用同源种和近缘种的ITS基因序列，用软件MEGA 7构建相关系统发育树（方法为Neighbour-Joining）[16-17]。利用bootstrap（1 000 次重复） 检验各分支的置信度[18]。

1.2.4 病原真菌的致病性测定

选择新鲜无病的建阳桔柚嫩枝，采用针刺接种法，叶片皮下注射孢子悬液（含量为1.0×107 cfu·mL-1）20 μL于嫩叶上，接种部位用润湿的滤纸保湿，培养3 d后去除滤纸，便于孢子萌发与侵染，嫩枝下部插入湿润的棉球团中保湿培养，接种后每天观察发病情况，待发病特征明显时，重新分离和鉴定病原菌。

2 结果与分析

2.1 病害症状

2.1.1 褐斑病的症状

该病害可为害建阳桔柚的叶片、新梢和果实，以新梢和幼果期发病受害最重。叶片染病初期为褐色针头状小点并伴有黄色晕圈，随着时间推移，病斑迅速沿叶脉不断扩大，形成带尾须状的病斑，出现深褐色霉状物，大多数病斑周围还有明显的黄色晕圈，这类病叶极易脱落（图1）。

2.1.2 炭疽病的症状

该病害可引起建阳桔柚落叶、枝梢枯死、果实腐烂及落果。为害叶片有两种症状类型：急性型（叶枯型）症状常从叶尖开始，初呈淡青色至暗褐色水渍状病斑，病、健部位边缘处很不明显，后变为淡黄或黄褐色，叶卷曲，叶片很快脱落;慢性型（叶斑型）多发生在成长叶片或老叶，从叶尖或近叶缘处开始，病斑圆形或近圆形，边缘褐色或深褐色，中间灰褐色、稍凹陷，病健部交界明显（图2）。

2.2 病原真菌形态学鉴定

2.2.1 褐斑病病原菌形态特征

从发生褐斑病的建阳桔柚叶片上分离出的菌株FJAT-32214在PSA平板培养基上的菌落颜色为灰褐色，产生黑褐色色素浸入培养基内，致菌落背面为黑褐色（图3）;分生孢子褐色，单生或链生，梨形、棍棒形或近短椭圆形，多呈链状分隔，长度8.5～30.1 μm、直径8.2～19.6 μm;分生孢子梗簇生或单生，直立或顶端稍弯曲，有分隔（图4）。参照陆家云[14]的相关描述，可初步将菌株FJAT-32214鉴定为链孢霉屬Alternaria sp.。

2.2.2 炭疽病病原菌的形態特征

从发生炭疽病的建阳桔柚叶片上分离出的菌株FJAT-32151在PSA培养基平板上的菌丝呈灰白色，绒状、茂密，后期会在菌落表面产生砖红色孢子堆，培养皿背面呈现不均匀的灰白色至黑褐色（图5）;分生孢子梗粗短，无色或淡褐色，基部分枝，梗无隔膜;分生孢子柱形或棒状，单胞，无色，表面光滑，两端钝圆，大小平均为15.8（13.4～19.5） μm×4.6（3.9～5.1） μm（图6）。初步鉴定为炭疽菌属Colletotrichum sp.。

2.3 病原菌的分子鉴定

将测序得到的菌株FJAT-32214、FJAT-32151的ITS序列提交到GenBank获得基因登录号分别为MN170555和MN170554，将2个菌株的ITS序列在NCBI、CBS-KNAW上进行比对，结果表明，菌株FJAT-32214与互隔交链孢霉Alternaria alternata、菌株FJAT-32151与胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides的相似性均在99%以上。同时，为了更直观地显示这2个菌株分别与其他链格孢、炭疽菌的亲缘关系，选用同源或近缘相应序列构建的系统进化树，结果表明，FJAT-32214与Alternaria alternata、菌株FJAT-32151与Colletotrichum gloeosporioides均以高相似度聚类在一起，而同属其他菌株的相似度则更低（图7～8）。综合病原菌的形态鉴定、NCBI与CBS-KNAW比对及系统发育树聚类结果，可以将这两种病原菌菌株FJAT-32214、菌株FJAT-32151分别鉴定为Alternaria alternata与Colletotrichum gloeosporioides。

2.4 病原真菌的致病性测定

接种后约15 d，接种不同病原菌的桔柚叶片上出现明显的褐斑病（图9）或炭疽病症状（图10），重新分离感病部位的病健交界处病组织，可分离到与接种病原菌相同的病原菌，证实所分离的病原菌是桔柚的致病菌。

3 讨论与结论

本文在田间病害调查的基础上，结合病理学及分子生物学鉴定对建阳桔柚在田间主要发生的炭疽病、褐斑病两种真菌性病害进行调查分析。通过症状观察、病原分离、致病性测定及分子鉴定确定了本次从建阳桔柚采集的炭疽病，其病原为胶孢炭疽菌C. gloeosporioides，褐斑病的病原菌是互隔交链孢霉Alternaria alternata。

链孢霉（又名链格孢）是农作物的主要致病菌之一，能引起粮食作物及果树、蔬菜和花卉等多种经济作物产生病害，导致严重的经济损失[19]。在柑橘上，链孢霉可以引起4种病害，其中互隔交链孢霉橘致病性A. alternate pathotype tangerine、柑橘链格孢褐斑病（Alternaria brown spot， ABS）可危害部分橘类、葡萄柚以及橘与柚、或橘与橙的杂交类柑橘，给感病柑橘品种生产带来巨大的困难[20]。链格孢褐斑病最早发现于澳大利亚，之后在北美洲、南美洲、地中海国家和欧洲、非洲等地的柑橘产区均有发生[21]，是柑橘生产中的一大限制因素。在国内，2010年Wang等[22]首次鉴定了云南省文山市塘房橘上的链格孢褐斑病，之后该病在重庆、浙江、湖南、广东、广西和四川等省区的红橘、瓯柑、椪柑、贡柑、八月橘、天草和默科特品种上均有发生，造成局部损失严重[23-24]。本研究则首次在建阳桔柚上鉴定到链格孢褐斑病。

由胶孢炭疽菌侵染引起的柑橘炭疽病是世界柑橘产区普遍发生的重要病害之一[25]，也是一种周年流行的病害，其发病程度与气候、栽培管理条件有着密切的关系。炭疽病是为害建阳桔柚较重的病害，可引起落叶、枝梢枯死，果实腐烂及落果;带病果实常在储运期间发生腐烂，所以其又是一种重要的采后病害。除了建阳桔柚外，广东的德庆贡柑[25]、重庆地区的甜橙、温州蜜柑、来檬等柑橘品种[26]、云南的塘坊橘[27]等都有发生严重炭疽病的报道。

因此，对于建阳桔柚上发生的褐斑病、炭疽病等真菌性病害，通过症状观察与PCR扩增鉴定相结合的早期诊断，有利于尽早针对性地开展药物防治，防止病害的传播、蔓延为害，减少病害造成的损失。

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（责任编辑：张 梅）