加热非燃烧状态下烟草制品的TSNAs释放规律

周慧明 华青 刘广超 等

摘  要：为了解加热非燃烧烟草制品加热时TSNAs的释放情况，以烟草薄片颗粒（RTPs）为原料，研究甘油含量、加热温度等对TSNAs释放的影响，并探究了其中NNN与NNK释放之间的关系。NNK和NNN释放量随加热温度升高而增加，达到240 ℃之后增量变小;NAB的释放量随温度升高不断上升;NAT的释放量先随温度升高而增加，达到240 ℃后基本稳定。同时，原料中添加甘油会不同程度地减少TSNAs的释放量。因此，烟草薄片颗粒中的甘油含量、加热温度显著影响TSNAs释放行为，合理的甘油含量和低温加热均可有效减少TSNAs的释放。原料中添加NNN后，NNK的释放量显著增加，推测 原料中NNN含量增加可能促进气溶胶中NNK的释放。

关键词：烟草;烟草特有亚硝胺;TSNAs;加热;释放

中图分类号：TS41+1          文章编号：1007-5119（2019）01-0082-07      DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.01.011

Abstract： In this work， the tobacco-specific nitrosamines （TSNAs） release behavior of reconstituted tobacco particles （RTPs） for heat-not-burn product （HNB） when heated has been investigated， and some influence factors， such as the glycerin content of tobacco material and the heating temperature， have been studied. Besides， the relationship between the release of NNN and NNK has been explored. NNK and NNN release amounts increased with heating temperature， and when the temperature reached 240 ℃， the increment decreased; NAB release amount increased with the increase of temperature; NAT release amount increased with the increase of temperature first， and became stable after the temperature reached 240 ℃. Meanwhile， the addition of glycerin to RTPs can reduce the release of TSNAs to varying degrees. Hence， glycerin content of RTPs and the heating temperature have both been shown to considerably influence the release values of TSNAs， while appropriate glycerin content and relatively low heating temperature could reduce the release of TSNAs efficiently. Besides， when NNN was added to RTPs， NNK release amount increased significantly， so it could be conjectured that the increase of NNN content in RTPs may promote the release of NNK in aerosol.

Keywords： tobacco; tobacco-specific nitrosamines; TSNAs; heated; release

加熱非燃烧烟草制品（HNB）将烟草原料加热而非直接燃烧，产生可吸入气溶胶。因其无需高温燃烧烟草，仅在相对低温下对烟草原料进行加热，减少了烟草高温燃烧裂解产生的有害成分，侧流烟气和环境烟气也大幅降低，因此有望成为一种既能给用户提供烟草抽吸的满足感、又可降低有害和潜在有害成分（HPHC）释放和吸入的产品，故而成为了当下的研究热点[1-3]。

烟草制品自身和烟气成分中含有多种HPHC，因此，有效地控制和降低其HPHC的释放量一直是烟草的重要发展方向和科研热点[4]。烟草及烟草制品中存在的N-亚硝胺可以分为4类：挥发性N-亚硝胺、非挥发性N-亚硝胺、带亚硝基的氨基酸和烟草特有亚硝胺（TSNAs），其中，TSNAs因其致癌性最受关注。TSNAs包含去甲基烟碱（NNN）、4-（N-甲基-N-亚硝胺）-1-（3-吡啶基）-丁酮（NNK）、N-亚硝基假木贼碱（NAB）、N-亚硝基新烟草碱（NAT）和4-（N-甲基-N-亚硝基氨基）-4-（3-吡啶基）-丁醛（NNA）以及NNK和NNA的衍生物4-（N-甲基-N-亚硝基氨基）-1-（3-吡啶基）-丁醇（NNAL）和4-（N-甲基-N-亚硝基氨基）-4-（3-吡啶基）-丁醇（iso-NNAL）等8种物质，NNN、NNK、NAB、NAT为其中主要的4种，是一类广泛存在于烟草制品和烟气中的HPHC。TSNAs是一组强致癌物质，国际癌症研究机构（IARC）将具有强动物致癌性的NNN和NNK两种物质列入一类致癌物，将NAT和NAB列入三类致癌物[5-7]。毋庸置疑，研究烟草制品和烟气中的TSNAs含量和释放规律，对于正确评价吸烟与健康的关系、推进低危害烟草制品的研究与发展具有重要意义。过去几十年里，科研人员一直不遗余力地对TSNAs的检测方法等进行了大量的研究，并且取得了许多科研成果[8-15]，然而这些研究主要是针对传统卷烟。

近年来，加热非燃烧烟草制品（HNB）逐渐成为热点，作为一种新型烟草制品，HNB的HPHC释放行为值得关注和研究，TSNAs作为一类关注度较高的有害物质，目前与之相关的报道并不多见。基于此，本文对HNB烟草原料的TSNAs释放行为进行了探究，采用气相色谱的色谱柱箱提供热源，吸烟机提供抽吸引擎，自主设计的石英管模拟HNB加热管，开发了一个模拟HNB的加热装置，对不同甘油比例和加热温度条件下HNB烟草原料的TSNAs释放行为进行研究，同时对加热过程中，NNN和NNK的释放关系进行探究。

1  材料与方法

1.1  材料

烟草材料采用烟草薄片颗粒，购于上海烟草集团有限责任公司，含水率7%，粒径1～2 mm。甘油（阿拉丁，分析纯，99%），甲醇（RCI Labscan，色谱纯），乙腈（TEDIA，色谱纯），乙酸铵（Sigma-Aldrich，色谱纯），甲酸铵（Sigma-Aldrich，质谱纯），甲酸（Sigma-Aldrich，质谱纯）。标准品：N-亚硝基去甲基烟碱rac N-itrosonornicotine（NNN），纯度≥98%;N-亚硝基新烟碱（R，S）-N-Nitrosoanatabine（NAT），纯度≥98%;N-亚硝基假木贼碱（R，S）-N-Nitrosoanabasine（NAB），纯度≥98%;4-（N-甲基-N-亚硝胺）-1-（3-吡啶基）-丁酮4-（Methylnitrosoamino）-1-（3-pyridyl）-1-butanone（NNK），纯度≥98%;氘代-N-亚硝基降烟碱rac N-Nitrosonornicotine-d4（NNN-d4），纯度≥99%;氘代-N-亚硝基新烟碱（R，S）-N-Nitrosoanatabine-2，4，5，6- d4（NAT-d4），纯度≥99%;氘代-N-亞硝基假木贼碱（R，S）-N-Nitrosoanabasine-d4（NAB-d4），纯度≥99%;氘代-4-（甲基亚硝胺基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮4-（Methylnitrosoamino）-1-（3-pyridyl-d4）-1-butanone （NNK-d4），纯度≥99%;标准品购自加拿大TRC公司。剑桥滤片（CFPs，Whatman，直径44mm），石英棉（CNW，GOEQ-003352硅烷化玻璃棉），电子天平（METTLER TOLEDO，CPE205，感量0.01mg），Agilent 6890B气相色谱仪，Milli-Q50超纯水仪（美国MILLIPORE公司），Agilent1290高效液相色谱仪（美国Agilent公司），AB SCIEX QTRAP 5500（美国AB SCIEX公司），KQ-700DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率1000 W）。

自主设计的石英管，结构如图1。主体部分两端开口、外径8 mm、内径6 mm，下部侧面连接弯折的外径6 mm、内径2 mm的细管，细管另外一端连接一段外径8 mm、内径6 mm的石英管。主体管与细管最大直径处为1.6 cm。主体管内部上端有卡口，可以固定住填充物，主体管上方连接捕集器和吸烟机的抽吸引擎。

采用SM400 20孔道吸烟机（英国Filtrona公司）提供抽吸装置。加热源采用安捷伦公司6890N气相色谱的色谱柱箱，尺寸为28 cm×31 cm×16 cm，使用温度为高于环境温度4 ℃至450 ℃，温度设置精度为1 ℃，最大升温速率为120 ℃/min，环境敏感度为环境温度变化1 ℃，箱内温度变化<0.01 ℃。色谱柱箱上方开3个直径为2 cm的孔，可将石英管顺利地放入和取出，结构如图2所示。经测试，改造后的色谱柱箱可以提供温度稳定的热源。

1.2  研究方法

1.2.1  烟草薄片颗粒样品制备  将适量的水与甘油混匀加入到适量的原含水率为7 %、不含甘油的烟草薄片颗粒样品中，搅匀，在恒温恒湿箱中放置72 h。用该方法制备了含水率16 %、甘油含量0、10、30%的样品，依次标记为A、B、C。向样品C中添加NNN，得到NNN为其原含量10倍的样品D。在搅拌过程中，甘油与水会发生少量挥发，因此，采用行业标准YC/T 243—2008烟草及烟草制品1，2-丙二醇、丙三醇的测定气相色谱法和YC/T 345—2010烟草及烟草制品水分的测定气相色谱法测定了样品的甘油含量和含水率，结果如表1。

1.2.2  烟草薄片颗粒样品热重（TG）分析  称取20～25 mg烟草薄片颗粒样品置于Pt坩埚中，N2吹扫，样品气流速20 mL/min，平衡气流速40 mL/min，从35 ℃升至500 ℃，升温速率为20 ℃/min，在500 ℃保持5 min，通过TG软件记录数据，得到热重（TG）曲线。将TG曲线进行一阶求导，得到DTG曲线。

1.2.3  样品受热释放的气溶胶中TSNAs捕集方法向石英管中先填充少量石英棉，加入适量的颗粒样品、末端填入少量石英棉，尾部塞上耐高温的密封垫，如图1所示。将气相色谱柱箱的温度设置为目标温度，达到目标温度并稳定5 min后，将装有待测样品的石英管放置于箱体上方的孔内，进行加热与抽吸。本实验采用ISO 4387抽吸方法，具体参数为：抽吸容量35 mL，每口抽吸时间2 s，抽吸间隔30 s，抽吸20口;并进行了3组平行试验。

1.2.4  颗粒样品与气溶胶中TSNAs含量测试方法采用CORESTA推荐方法N° 72无烟气烟草样品中TSNAs的检测方法。制备的样品TSNAs含量的实测值如下表，所有数值均计以去水去甘油的单位干重的原料对应的含量。

2  结  果

2.1  不同甘油含量的烟草薄片颗粒样品的TG、DTG分析

为了获知样品适宜的加热温度区域，首先对样品进行了热重（TG）分析。图3为A、B、C三种样品的热重（TG）与相应的微分热重（DTG）曲线图。从图3中可知，图中曲线的走势与文献[16-18]中类似试验条件下的研究结果一致，在试验温度范围内，随着热解温度的不断上升，样品经历了明显的热失重过程。为了清晰地描述具体现象，根据曲线的波动特征，将TG、DTG曲线分成三个区间进行分析，125 ℃之前，125～270 ℃，270 ℃之后。从曲线图中可见，在125 ℃之前，100 ℃附近为水失重峰，样品A的水失重峰显著提前于B、C，样品B的水失重峰提前于C。该现象是由甘油的保润性引起，样品A中不含甘油，水分较易释放，C中甘油含量最高，因而水失重峰出现最晚。当温度达到125 ℃之后，样品B、C的失重峰显著提前于A，从DTG曲线中可见，从125 ℃至270 ℃，A、B、C的失重峰峰面积依次增大，这主要是由于样品中甘油的挥发以及随甘油挥发携带的其他化合物的释放引起。在270 ℃之后，失重峰的最高处位于300 ℃左右，因此在270 ℃之后，样品在300 ℃左右失重速度最快，在300 ℃下加热可以使样品充分释放气溶胶。当温度达到300 ℃时，样品A、B、C的残余质量分别为62.34%、48.81%、32.96%，残余质量之间的差异，与样品中甘油含量的实测值之间的差异吻合，因此，残余质量之间的差异主要是由甘油含量的差异引起。由TG与DTG曲线可知，样品A、B、C在150～300 ℃段发生了显著的热解过程，且许多HNB产品将目标加热温度设置在该温度段，因此本文将选择在该温度段探究TSNAs的释放规律。

2.2  烟草薄片颗粒样品TSNAs释放规律

根据2.1的分析，本文选择在150～300 ℃温度段探究TSNAs的释放规律，重点关注加热温度及甘油含量对TSNAs释放行为的影响。图4反映了3种样品在不同温度加热时TSNAs的释放现象。随着加热温度的上升，NNK的释放量逐渐增加，达到240 ℃之后增量变小;NNN的释放量先随温度升高而增加，超过240 ℃后稍有减少;NAB的释放量随温度升高不断上升;NAT的释放量先随温度升高而增加，达到240 ℃后基本稳定。

此外，从图4可见，甘油含量对TSNAs的释放也有较为明显的影响，尤其是对NNK与NNN释放的影响非常显著。在相同的试验条件下，样品C的NNK与NNN释放量基本低于A与B，210 ℃以上时，样品C的NNN释放量则显著低于其他两种样品，NAB和NAT的释放也呈现出相似的趋势。

2.3  NNN与NNK释放关系的比较

比较表2中原料所含TSNAs的实测值与图4中测得的TSNAs的释放量可知，NNK的释放量超过了其在原料中的含量，而NNN则相反，基于以上现象，进行了以下试验。参照样品C中NNN的含量，补加NNN，制备得到NNN含量约为原来10倍的样品D，考察NNN和NNK之間是否存在相互影响的可能。将样品C、D在加热温度为180、240、300 ℃的条件下进行TSNAs释放量的测试，并将原料中NNK、NNN含量（表2）和气溶胶中的释放量（表3）进行比较。

经计算，240 ℃时，样品C的NNK释放量相对于原料中的含量提高了约24.3%，D则增加了更多，为110.3%。因此，样品中NNN含量增加引起了NNK释放量增加。

3  讨  论

本研究重点关注了加热温度及甘油含量对TSNAs释放行为的影响。气溶胶中的TSNAs一部分来源于烟草原料中含有的TSNAs的直接转移，另一部分源于加热抽吸过程中由烟碱、去甲基烟碱等反应形成和释放[19-21]。加热时，原料中的TSNAs转移到气溶胶中，随着加热温度升高，迁移速率不断上升直至平衡，同时，由反应生成的TSNAs也不断增加，因而气溶胶中TSNAs含量不断增加。当温度继续升高时，反应过程变得更加复杂，部分TSNAs呈现释放量稍有减少的现象。

甘油是一种烟草制品中常用的添加剂，可作为保湿剂混入烟草制品中，以降低制卷后水分损失的速度。它还可以作为主要的气溶胶剂，帮助增加总气溶胶物质（ACM），在HNB产品中帮助携带尼古丁、香味和香气成分[22]。此外，根据前人分析，甘 油还可能与烟草原料发生相互作用，影响气溶胶的成分[23]。烟草原料中添加甘油后受热释放的TSNAs减少，可能是由于加热温度较高时，甘油汽化吸热，带走了反应体系内的部分热量，使得相同的外部加热条件下，样品C的体系实际温度低于样品A、B，从而TSNAs的释放量也最低。

综上所述，样品中的甘油含量与加热温度均是TSNAs释放过程中不可忽视的影响因素，相对较低的加热温度与适当比例的甘油均可以减少TSNAs的释放。

原料中添加NNN引起NNK释放量增加可能是由下述原因导致：反应体系中，存在反应NNK?烟碱?去甲基烟碱?NNN[24-25]，烟碱可反应生成NNK，去甲基烟碱可反应生成NNN[19]。加热状态下，除直接从原料中迁移的NNK以外，其他途径生成NNK，如烟碱生成NNK的反应速率增加，因此NNK的释放量增加。当样品中NNN添加之后，抑制了上述反应向右方进行而促进了其向左方进行，导致NNK的释放量增加。另外，也曾有文献报道，NNN和NNK可能存在共同的热生成机理[12]，因此，NNN与NNK的生成之间存在竞争关系，高温时，NNK的生成具有优势，超越了NNN的生成，这也是该现象可能的原因之一。目前，仍无对NNN与NNK两者的生成之间是否存在关联的直接证据报道。

4  结  论

基于自主设计的一套捕集检测装置，探究了加热非燃烧状态下烟草原料的TSNAs释放规律。研究结果表明，烟草薄片颗粒中的甘油含量、加热温度均是烟草薄片颗粒的TSNAs释放行为的重要影响因素，样品中适量的甘油和低温加热均可有效降低TSNAs的释放。因此，设计具有适量甘油的烟草原料、采用相对较低的加热温度的HNB产品可以减少用户的TSNAs摄入。烟草原料中NNN含量增加可能促进气溶胶中NNK的释放量增加。

参考文献

[1]张兴伟，邢丽敏，齐义良，等. 新型烟草制品未来发展探讨[J]. 中国烟草科学，2015，36（4）：110-116.

ZHANG X W， XING L M， QI Y L， et al. Discussion on the development of novel tobacco products[J]. Chinese Tobacco Science， 2015， 36（4）： 110-116.

[2]窦玉青，沈轶，杨举田，等. 新型烟草制品发展现状及展望[J]. 中国烟草科学，2016，37（5）：92-97.

DOU Y Q， SHEN Y， YANG J T， et al. The development and prospect of novel tobacco products[J]. Chinese Tobacco Science， 2016， 37（5）： 92-97.

[3]劉秀华，钟志京，谢云，等. 烟丝热解气体产物中有机物的分析[J]. 中国烟草科学，2007，28（6）：13-16.

LIU X H， ZHONG Z J， XIE Y， et al. Analysis of organic components in gaseous pyrolysis products of cut rags. Chinese Tobacco Science， 2007， 28（6）： 13-16.

[4]LU X L. Harmful and potentially harmful constituents in tobacco products and tobacco smoke; established list[J]. Federal Register， 2012， 77（64）： 20034-20037.

[5]HECHT S S. Biochemistry， biology， and carcinogenicity of tobacco-specific n-nitrosamines[J]. Chemical Research in Toxicology， 1998， 11（6）： 559-603.

[6]IARC Monographs. Tobacco Smoke andInvoluntary Smoking[M]//IARC Monographs on the Evaluation ofCarcinogenic Risks to Humans. Lyon： IARCPress， 2004.

[7]HECHT S S， HOFFMANN D. Tobacco-specific nitrosamines， an important group of carcinogens in tobacco and tobacco smoke[J]. Carcinogenesis， 1988， 9（6）： 875-884.

[8]BHIDE S V， NAIR J， MARU G B. Tobacco-specific N-nitrosamines [TSNA] in green mature and processed tobacco leaves from India[J]. Beitr?ge Zur Tabakforschung， 2015，14（1）： 29-32.

[9]DING Y S， ZHANG L， JAIN N， et al. Levels of tobacco-specific nitrosamines and polycyclic aromatic hydrocarbons in mainstream smoke from different tobacco varieties[J]. Cancer Epidemiology， Biomarkers & Prevention， 2008， 17（12）： 3366-3371.

[10]BURTON H R， DYE N K， BUSH L P. Distribution of tobacco constituents in tobacco leaf tissue. 1. Tobacco-specific nitrosamines， nitrate， nitrite， and alkaloids[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry， 1992， 40（6）： 1050-1055.

[11]LAW A D， FISHER C， JACK A， et al. Tobacco， microbes， and carcinogens： correlation between tobacco cure conditions， tobacco-specific nitrosamine content， and cured leaf microbial community[J]. Microbial Ecology， 2016， 72（1）： 120-129.

[12]LIPOWICZ P J， SEEMAN J I. A model to estimate the sources of tobacco specific nitrosamines in cigarette

smoke[J]. Chemical Research in Toxicology， 2017， 30（8）： 1556-1561.

[13]蒋腊梅，练文柳，丁时超，等. 卷烟侧流烟气中有害醛酮类化合物的分析[J]. 烟草科技，2012（1）：47-51.

JIANG L M， LIAN W L， DING S C， et al. Analysis of harmful aldehyde and ketone compounds in sidestream cigarette smoke[J]. Tobacco Science & Technology，

2012（1）： 47-51.

[14]李宗平，覃光炯，陈茂胜，等. 不同栽培方式对白肋烟烟碱转化率及TSNA含量的影响[J]. 中国烟草科学，2015，36（6）：62-67.

LI Z P， QIN G J， CHEN M S， et al. Influence of different cultivation methods on nicotine conversion and TSNA content of burley tobacco[J]. Chinese Tobacco Science， 2015， 36（6）： 62-67.

[15]熊巍，陶曉秋，韶济民，等. Dis-SPE-UPLC-MS/MS测定卷烟主流烟气中4种TSNAs[J]. 中国烟草科学，2018，39（4）：87-93.

XIONG W， TAO X Q， SHAO J M， et al. Determination of four tobacco-specific N-nitrosamines in tobacco mainstream smoke by dispersive solid phase extraction-UPLC-MS/MS[J]. Chinese Tobacco Science， 2018， 39（4）： 87-93.

[16]SENNECA O， CHIRONE R， SALATINO P， et al. Patterns and kinetics of pyrolysis of tobacco under inert and oxidative conditions[J]. Journal of Analytical &Applied Pyrolysis， 2007， 79（1）： 227-233.

[17]G?MEZ-SIURANA A， MARCILLA A， BELTRAN M， et al. Study of the oxidative pyrolysis of tobacco– sorbitol–saccharose mixtures in the presence of MCM-41[J]. ThermochimicaActa， 2012， 530（1）： 87-94.

[18]童保云，张晓宇，孔俊，等. 烤烟烟叶叶片及其烟梗的热分解过程和动力学[J]. 烟草科技，2013（12）：54-58.

TONG B Y， ZHANG X Y， KONG J， et al. Comparison of pyrolysis process and kinetics between tobacco lamina and stem with thermogravimetricanalysis[J]. Tobacco Science & Technology， 2013（12）： 54-58.

[19]谢剑平. 卷烟危害性评价原理与方法[M]. 北京：化学工业出版社，2009.

XIE J P. Principles and methods of evaluation of cigarette hazard[M]. Beijing： Chemical Industry Press， 2009.

[20]FISCHER S， SPIEGELHALDER B， EISENBARTH J， et al. Investigations on the origin of tobacco-specific nitrosamines in mainstream smoke of cigarettes[J]. Carcinogenesis， 1990， 11（5）： 723-730.

[21]ADAMS J D， LEE S J， VINCHKOSKI N， et al. On the formation of the tobacco-specific carcinogen 4-（methylnitrosamino）-1-（3-pyridyl）-1-butanone during smoking[J]. Cancer Letters， 1983， 17（3）： 339-346.

[22]G?MEZ-SIURANA A， MARCILLA A， BELTR?N M， et al. TGA/FTIR study of tobacco and glycerol–tobacco mixtures[J]. ThermochimicaActa， 2013， 573： 146-157.

[23]BAKER R R， DA SILVA J R P， SMITH G. The effect of tobacco ingredients on smoke chemistry. Part II： casing ingredients[J]. Food and Chemical Toxicology， 2004， 42： 39-52.

[24]史志宏，BUSH L P，WANG J，等. 我国不同类型烟叶烟碱向降烟碱转化研究[J]. 中国烟草科学，2001，22（4）：6-9.

SHI Z H， BUSH L P， WANG J， et al. Conversion of nicotine to nornicotine in Chineses tobacco of different types[J]. Chinese Tobacco Science， 2001， 22（4）： 6-9.

[25]TSOTC. Physiology and biochemistry of tobacco plants[M]. Stroudsburg： Dowden， Hutchinson & Ross， Inc.， 1972.