烟草疫霉菌拮抗细菌的筛选鉴定及发酵条件优化

李小杰 李成军 刘红彦 等

摘  要：为了筛选对烟草疫霉菌具有拮抗作用的生防细菌菌株，本研究从烟草黑胫病病圃地采集健康烟株的根际土样，采用对峙培养法筛选得到8株对烟草黑胫病具有拮抗作用的细菌菌株，其中编号为LB-9的菌株对烟草疫霉菌的抑制作用最强且效果稳定，抑菌率为60.6%，且抑菌谱广，对其进行16S rRNA基因序列分析后将该菌株鉴定为多粘芽孢杆菌。采用单因素优化试验初步探究了多粘芽孢杆菌LB-9的最适发酵条件，明确了LB-9的最适发酵培养基、最适发酵温度、最适发酵时间和最适发酵初始pH值，对其生防制剂的开发应用具有重要意义。

关键词：烟草疫霉;拮抗细菌;筛选鉴定;发酵条件

中图分类号：S435.72          文章编号：1007-5119（2019）01-0068-07      DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.01.009

Abstract： In order to screen the bacterial strains which have antagonistic effects on Phytophthora nicotianae and provide favorable resources for the biological control of tobacco black shank disease in Henan tobacco areas， the rhizosphere soil samples of healthy tobacco plants were collected from tobacco black shank disease nursery and eight bacterial strains were screened by confrontation culture method. Among them， the strain LB-9 had the strongest and stable inhibitory effect on P. nicotianae with a bacteriostatic rate of 60.6% and a broad spectrum. The strain was identified as Paenibacillus polymyxa by 16S rRNA gene sequencing analysis. The optimum fermentation medium， temperature， time and initial pH value of LB-9 were determined by single factor optimization test which has great significance to the development and application of biocontrol agents.

Keywords： Phytophthora nicotianae; antagonistic bacteria; screening and identification; fermentation condition

煙草黑胫病是我国烟草的主要根茎部病害，最早发生于黄淮烟区[1-3]，目前各主要产烟区均有不同程度的发生，是烟叶毁灭性病害之一。近年来，由于连作烟田面积不断扩大以及连作年限不断增加，加重了该病害的流行。据不完全统计，我国平均每年因烟草黑胫病造成的经济损失达1亿元以上[1]。

目前生产上对于烟草黑胫病的防治，主要采用甲霜灵和锰锌类的复配制剂进行防治，由于长期、过量或不规范用药，导致甲霜灵、代森锰锌的降解物成为目前我国烟叶中的主要农药残留成分[4-5]。与此同时，病原菌对此类药物的抗药性也不断增强，药效有所降低。因此，采用高效生防菌剂对烟草黑胫病进行生物防治，有利于减少烟叶农药残留、降低环境污染，对维护农田生态平衡和烟叶绿色生产具有重要意义。

制备高效生防菌剂的重要基础是筛选效果突出的拮抗菌株，目前关于筛选拮抗微生物以防治烟草黑胫病的研究较多[6-10]。其中在生防细菌研究方面，较多的是芽孢杆菌，它能够产生耐热、耐旱、抗紫外线等的内生孢子和多种抗菌素以及酶类物质，具有极强的抗逆性和广谱抗菌活性，目前已被广泛应用于水稻、大豆、棉花、小麦、辣椒、番茄、烟草等多种植物真菌病害的防治[7，11-14]，包括植物根、茎部病害、叶、花部病害和收获后果品病害等[15-17]。

虽然越来越多的生防菌株被挖掘出来，且具有较好防效，但不同地域或寄主植物间防效存在巨大差异。本研究主要针对河南烟区烟草黑胫病，筛选对其具有较好拮抗效果的细菌菌株，并对其发酵条件进行优化，以期为其生防制剂的开发应用提供有利资源和基础，同时对河南烟区烟草根茎类病害的生物防治具有重要指导意义。

1  材料与方法

1.1  试验材料

供试病原真菌菌株河南烟区烟草疫霉菌优势生理小种1号小种、尖孢镰刀菌、立枯病菌由本实验室（烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室）分离保存;烟草根黑腐病菌、轮枝镰刀菌、溃疡病菌、炭疽病菌、灰霉病菌、菊花壳二孢、拟茎点霉由河南科技大学康业斌教授惠赠，本实验室保存。土样采集于河南省农业科学院烟草研究所烟草黑胫病病圃地健康烟株的根际土壤。

拮抗细菌的分离、培养用LB培养基，烟草疫

霉菌的培养用燕麦培养基（OA），供试的其他几种病原真菌的培养用PDA培养基。拮抗细菌总DNA提取、16S rDNA片段扩增所用试剂均购自天根生化科技有限公司。

1.2  土壤细菌的分离与筛选

称取10 g土样置于90 mL无菌水中，在28 ℃摇床上振荡30 min。采用梯度稀释法[1]，制备10-2、10-3、10-4稀释液，各取0.1 mL涂布在固体LB平板上，28 ℃培养48 h。挑取培养特征明显不同的单菌落，于LB平板进行划线纯化，将纯化好的菌株保存于4 ℃冰箱备用。

采用平板对峙培养法筛选对烟草疫霉菌具有抑制作用的细菌菌株。将疫霉菌在燕麦培养基上25 ℃培养7 d，用灭菌手术刀切取适当大小的菌块，接入新的燕麦平板培养基中央，用灭菌牙签将待测拮抗细菌点接于菌块周围等距离处，于25 ℃培养5 d，观察并记录抑菌圈的有无以及抑菌圈的半径。每个处理重复3次，筛选出有抑菌圈的菌株，并计算其抑菌率。抑菌率=（对照平板菌落直径-处理平板菌落直径）/对照平板菌落直径×100%。复筛方法同初筛，再次筛选抑菌圈大且效果稳定的菌株。

1.3  拮抗菌的16S rDNA鉴定

用细菌基因组DNA提取试剂盒提取拮抗菌株的基因组DNA，并以细菌16S rRNA基因的通用引物（F： 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，R： 5'-TACCTTGTTACGACTT-3'）对菌株的16S rRNA基因进行PCR扩增。引物由生工生物有限公司合成。PCR反应体系（25 μL）为：Taq酶0.3 μL，10×Buffer（Mg2+）2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 17.2 μL。PCR反应条件为：95℃ 5 min，95 ℃ 45 s，52 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，28个循环，72 ℃延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，将PCR产物送测序，测序结果在NCBI上进行Blast比对，并选择同源性较高的序列用Neighbor-Joining法构建系统发育树。

1.4  拮抗菌株LB-9的抑菌谱测定

采用平板对峙培养法，分别测定拮抗菌株LB-9对烟草根黑腐病菌、尖孢镰刀菌、轮枝镰刀菌、立枯病菌、溃疡病菌、炭疽病菌、灰霉病菌、菊花壳二孢、拟茎点霉的抑制效果，具体方法参照1.2.2。

1.5  拮抗菌株LB-9发酵条件的优化

1.5.1  最适培养基的确定  选取3种培养基为拮抗菌LB-9的候选培养基，培养基配方如下：

培养基一：葡萄糖15 g，玉米粉15 g，豆粕15 g，氯化钠2 g，磷酸二氢钠3 g，硫酸镁0.7 g，碳酸钙1 g/L。

培养基二：玉米粉25 g、葡萄糖15 g、玉米蛋白粉/豆粕15 g、NaCl 1.3 g、MgSO4 0.4 g、K2HPO4 0.8 g、CaCO3 2 g/L。

培养基三：葡萄糖10 g，豆粕/玉米蛋白粉10 g，MgSO4 0.2 g/L，pH 7.5～7.6。

采用涂板计数法测定拮抗菌在3种培养基中发酵24 h与48 h的活菌量，确定最适发酵培养基。

1.5.2  最适发酵时间的确定  以最适候选培养基为基础培养基。发酵基础条件为：培养温度28 ℃、摇床转速150 r/min、发酵起始pH 7.0、接种量1%、装液量200 mL/500 mL，监测发酵72 h間的活菌数量和芽孢数量，确定最佳发酵时间。

1.5.3  最适发酵温度的确定  以最适候选培养基为基础培养基。发酵基础条件为：转速150 r/min、发酵起始pH 7.0、接种量1%、装液量200 mL，培养温度为28 ℃、30 ℃、33 ℃、37 ℃，监测发酵72 h的活菌数量和芽孢数量，确定最佳发酵温度。

1.5.4  最适初始pH值的确定  以最适候选培养基为基础培养基。发酵基础条件为：培养温度30 ℃、摇床转速150 r/min、接种量1%、装液量200 mL，培养pH为5、6、7、8、9，监测发酵72 h后的芽孢数量，以芽孢数量确定最佳发酵pH。

1.6  数据分析

利用DPS 7.05软件进行显著性检验，采用Duncan新复极差法进行差异显著性比较。

2  结  果

2.1  烟草疫霉菌拮抗细菌的分离和筛选

采用平板梯度稀释法共分离出80株形态不同的菌株，经过初筛和复筛，共得到8株对疫霉菌具有拮抗效果的细菌菌株。其中菌株编号分别为LB-9、LB-21、A27的抑菌效果较好，抑菌率均达到50.0%以上。尤其菌株LB-9的拮抗效果最好，抑菌圈半径达到1.0 cm，抑菌率为60.6%（图1）。在转移5代后，其抑菌效果表现稳定。

2.2  拮抗菌LB-9的16S rRNA 基因序列分析

系统发育树分析结果表明（图2），菌株LB-9的16S rRNA基因序列与跟其比对的芽孢杆菌属同源相似度在99%，将该菌株归属为芽孢杆菌属;同时其与多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）的16S rRNA基因序列同源性为99%，且位于同一进化分支。

2.3  拮抗多粘芽孢杆菌LB-9的抑菌谱分析

抑菌谱测定结果表明（图3），多粘芽孢杆菌LB-9对烟草根黑腐病菌、尖孢镰刀菌、轮枝镰刀菌、立枯病菌、溃疡病菌、炭疽病菌、灰霉病菌、菊花壳二孢、拟茎点霉均具有抑制作用，其中对烟草根黑腐病菌的抑制作用最强，抑菌圈半径达1.8 cm。由此说明，LB-9的抑菌谱广，具有较好的应用前景。

2.4  拮抗多粘芽孢杆菌LB-9的发酵条件优化

2.4.1  最适生长培养基  3种培养基对LB-9生长状况的影响差别明显（图4）。芽孢杆菌LB-9在培养基一中几乎不生长;在培养基二中24 h与48 h的菌量变化不大;在培养基三中，发酵48 h时其活菌量极显著高于发酵24 h及在其他两种培养基中的活菌量。由此确定，芽孢杆菌LB-9的最适发酵培养基为培养基三。

2.4.2  发酵时间对拮抗菌生长量的影响  发酵时间对芽孢杆菌LB-9活菌量与芽孢数的影响较大（图5）。发酵48 h内LB-9活菌量和芽孢数缓慢增长，发酵72 h时活菌量与芽孢数均极显著高于其它发酵时间的活菌量与芽孢数。因此确定最适发酵时间为72 h。

2.4.3  发酵温度对拮抗菌生长量的影响  由图6可以看出，随着培养温度的升高，LB-9的活菌量和芽孢数先增加后降低。当发酵温度为30 ℃时LB-9 的活菌量与芽孢数均达到最大值，其中活菌量极显著高于其他处理，而芽孢数与其他处理之间差异不明显。随后，其活菌量和芽孢数均逐渐下降。由此得出，LB-9的最适发酵温度为30 ℃。

2.4.4  初始pH值对拮抗菌生长量的影响  结果表明（图7），当培养基初始pH值为7时LB-9的芽孢数最多，极显著高于其他处理。随着pH值的升高，LB-9的芽孢数逐渐减少，当培养基初始pH值为9时，其芽孢数基本与pH为5时的芽孢数相当。由此判断，LB-9的最适发酵初始pH值为7。

3  讨  论

芽孢杆菌属革兰氏阳性杆菌，生理特征丰富多样，分布极其广泛。目前已报道的生防芽孢杆菌种类有枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、蜡状芽孢杆菌（B. cereus）、多粘芽孢杆菌（P. polymyxa）、巨大芽孢杆菌（B. megaterium）、短小芽孢杆菌（B. pumilus）和解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）等[18-19]，其中多粘芽孢杆菌是一类重要的植物生防细菌和根际有益促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR），兼具促生长和病害防治的作用[20-24]，在农业领域应用广泛。本研究从健康烟株的根际土中筛选出8株对烟草疫霉菌具有拮抗作用的细菌，其中多粘芽孢杆菌LB-9的拮抗效果最好且稳定，同时对烟草其他根茎部真菌病害也具有广谱抗性，应用前景良好。本研究与吴秉奇等[23]的研究结果相比，多粘芽孢杆菌对烟草黑胫病的抑制效果有明显差别，分析其原因可能在于菌株的来源不同，至于LB-9是否具有促进烟株生长的作用还需进一步研究。

不同的拮抗菌菌株，其最适生长条件不同，将影响其活菌数量、比例以及对病原菌的抑制效果。曹琦琦等[25]的研究结果表明，枯草芽孢杆菌NB12在pH 7.0，温度30 ℃的LB或BPY培养液中培养48 h，其生长量最大。张镜等[26]认为，多产色链霉菌Act0988拮抗菌的最适温度是28 ℃，最适pH为7.0，对其生长和繁殖影响较大。赵德立等[27]的研究表明，应用LB培养基培养，初始pH 9.0，30 ℃，通气量100 mL，接种量为10%，140 r/min振荡培养72 h时的多粘芽孢杆菌JW-725发酵液对柑橘青霉具有很强的拮抗作用。本研究采用单因素优化试验，确定多粘芽孢杆菌LB-9的最适发酵培养基为葡萄糖10 g，豆粕/玉米蛋白粉10 g，MgSO4 0.2 g/L;最適发酵温度为30℃;最适发酵时间为72 h;最适发酵初始pH值为7。结果表明，发酵条件的不同导致多粘芽孢杆菌LB-9的生长量具有显著差异。下一步将对LB-9发酵液的生防效果及抑菌机理等方面进行深入研究。

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