适于烟草生物反应器的真核生物源虾青素合成酶筛选

方宁 王春凯 刘晓峰 等

摘  要：为揭示不同真核生物源虾青素合成酶在烟草中的异源表达生物活性特征，明确开发虾青素烟草生物反应器的关键分子基础，本研究对夏侧金盏花（Adonis aestivalis）、雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）及红发夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）3种真核生物源虾青素合成酶基因进行了密码子优化合成及表达载体构建，通过农杆菌介导的瞬时表达和稳定表达试验比较了其在烟草中合成虾青素的活性差异。结果表明，3种来源的虾青素合成酶基因均能在烟草中表达，但是仅夏侧金盏花和雨生红球藻来源的合成酶能在烟草中特异合成虾青素，且夏侧金盏花虾青素合成酶的活性最高。此外，稳定表达体系优于瞬时表达体系，能准确展示不同虾青素合成酶的活性差异。本研究为真核生物源虾青素合成酶在烟草生物反应器中的应用提供了重要基础。

关键词：生物反应器;烟草;虾青素合成酶;植物;微藻;酵母

中图分类号：S572.03          文章编号：1007-5119（2019）01-0009-08      DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.01.002

Abstract： In order to determine the bioactivity of eukaryotes astaxanthin synthase ectopically expressed in tobacco， and to reveal the molecular basis for the development of tobacco bioreactor for astaxanthin， we codon-optimized and synthesized three eukaryotic-type astaxanthin synthases from Adonis aestivalis， Haematococcus pluvialis and Xanthophyllomyces dendrorhous respectively， and compared their astaxanthin synthetic bioactivities in tobacco using both transient and stable expression experiments. The results showed that the genes of the three resources were all successfully expressed in tobacco， whereas only the A. aestivalis- and H. pluvialis-derived synthases could specifically synthesize astaxanthin， and the A. aestivalis-derived astaxanthin synthases possessed a higher activity. The results also suggested that the stable expression system was more sensitive than the transient expression system in determining the activity of astaxanthin synthetic enzymes in tobacco. This study has provided molecular basis for the construction of tobacco bioreactor for astaxanthin synthesis.

Keywords： bioreactor; tobacco; astaxanthin synthetic enzyme; plant; algae; yeast

虾青素是一种含酮基的氧化型类胡萝卜素，广泛存在于虾、蟹、鱼、藻以及鸟类羽毛中[1-3]。虾青素的特殊化学结构使其具有极强的抗氧化活性，在心脑血管疾病、糖尿病、癌症及免疫疾病等的预防和治疗中有积极意义，具有广阔的市场前景[4-7]。目前，天然虾青素的生产主要依赖于雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）及虾蟹废弃物的提取，普遍存在原料获取效率低、生产成本高的客观问题，无法满足快速增长的市场需求[1]。研究虾青素生物合成的分子基础，开发其高效生物反应器是克服现有原料问题的重要途径。

烟草（Nicotiana tabacum）具有生物量大、次生代谢旺盛的突出优势，是重要的植物生物反应器开发平台[8-10]，在虾青素生物反应器开发研究中一直受到关注[11-12]。研究表明，虾青素的生物合成以β-胡萝卜素为前体物，通过对β-紫罗兰酮环3，3’和4，4’位添加羟基和酮基形成[13-14]。能够自身合成虾青素的生物包括：微生物、微藻以及数量有限的真菌和植物。不同生物对β-紫罗兰酮环添加羟基和酮基的机理不同，相关功能酶类也存在极大分子差异。在细菌中，以副球菌（Paracoccus sp.）為例，该过程依赖于β-胡萝卜素酮基化酶CrtW和羟基化酶CrtZ的作用[15-16];在藻类中，以雨生红球藻为例，该过程由β-胡萝卜素酮基化酶BKT（CtrO）和羟基化酶CHYb催化[11，17];在植物夏侧金盏花（Adonis aestivalis）中，由类胡萝卜素4-羟基-β-环4-脱氢酶（HBFD）的加羟基作用和类胡萝卜素β-环-4-脱氢酶（CBFD）的脱氢作用分两步完成4和4’位酮基添加，最后在HBFD的加羟基作用下添加3和3’位羟基，最终形成虾青素[18-19];在红发夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）中，由虾青素合成酶CrtS借助细胞色素还原酶CrtR的辅助完成β-胡萝卜素的酮基和羟基添加[20-21]。在前期研究中，虾青素的烟草生物反应器构建主要采用改造的微生物源虾青素合成酶进行，有关真核生物源虾青素合成酶在烟草生物反应器中的应用研究还非常欠缺。深入研究真核生物源虾青素合成酶在烟草生物反应器中的活性，对高效虾青素烟草生物反应器的开发具有重要科学意义。

本试验将夏侧金盏花、雨生红球藻及红发夫酵母的虾青素合成酶关键基因进行密码子优化合成后，通过瞬时表达和稳定表达试验将上述基因导入烟草植株TN90，比较分析了不同真核生物源虾青素合成关键酶在烟草中合成虾青素的活性差异，以期为虾青素烟草生物反应器的开发提供分子基础。

1  材料与方法

1.1  试验材料

试验所需烟草（Nicotiana tabacum cv. TN90）材料，大肠杆菌DH5α，农杆菌GV3101、LBA4404，以及稳定表达载体pBin19-attR-HA为本实验室保存材料。瞬时表达载体pCAM：pGR106[22]由云南省烟草农业科学研究院惠赠。大肠杆菌热激感受态细胞及农杆菌冻融法转化感受态细胞均按常规方法制备。

试验所需常规化学试剂、分子生物学试剂、细菌抗生素，配制LB（Luria-Bertani）培养基、YEB（Yeast Extract Beef）培养基和MS（Murashige & Skoog）培养基所需生物试剂，以及构建质粒载体所需内切酶、质粒小量提取试剂盒和DNA片段琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自生物工程（上海）股份有限公司。Gateway克隆所需LR Clonase® II重组酶购自美国Invitrogen公司。虾青素提取和高效液相检测所需有机溶剂购自国药集团化学试剂有限公司，虾青素标准品购自SIGMA公司。

1.2  植物材料培养

试验所需烟草植株均于25 ℃，光周期为14 h光照/10 h黑暗的室内温室中培养。6周龄的烟草植株用于农杆菌GV3101介导的瞬时表达试验。在稳定表达试验中，用MS固体培养基培养的无菌TN90烟草幼苗作为外植体，以农杆菌LBA4404介导的叶盘转化法培育稳定表达材料。

烟草TN90的无菌苗培养：将烟草种子用消毒液（含5%立白®漂洗液，0.05% Tween20）消毒7 min，并用无菌水洗涤3次后，播种于MS固体培养基上于室内温室培养。

1.3  虾青素合成酶基因的密码子优化及合成修饰

雨生红球藻是植物界绿藻门生物，红发夫酵母是真菌界真菌门生物，与烟草的生物差异较大。为使二者的虾青素合成酶能在烟草中取得异源表达效果，在合成雨生红球藻虾青素合成酶基因BKT（CtrO）（AY603347.1）和chyb（KP866868.1）以及红发夫酵母虾青素合成酶基因CrtS（HG939455.2）和CrtR（LN554258.1）时，先依据其GenBank的登录序列进行密码子优化，以符合植物的密码子偏好性。夏侧金盏花与烟草同属植物界被子植物门双子叶植物纲，相互间可实现基因的异源表达，因此，其虾青素合成酶基因AdKeto（AY644757.1）和AdKc

（DQ902555.1）的合成依据其在GenBank的登录序列直接进行。

为使各生物来源的β-胡萝卜酮基化酶和羟基化酶在烟草中的表达水平相对一致，本研究采用了单转录框的双基因串联表达设计，两个串联基因间通过2A剪切肽进行连接，以使两个编码蛋白在翻译后可通过2A肽段剪切分离并发挥各自功能[23]。2A肽段的添加以及双基因的串联均通过全基因合成完成。此外，因雨生红球藻和红发夫酵母中合成虾青素的细胞器与植物不同，特意在其虾青素合成酶序列的末端增加了叶绿体定位肽（CTS），以使编码蛋白能够在烟草叶绿体内发挥功能。图1的载体构建示意图中可见双基因串联设计结构。

1.4  瞬时表达载体构建及试验方法

在合成以2A肽段序列串联的酮基化酶和羟基化酶基因序列片段后，利用限制性内切位点Sca I和Asc I将其克隆入pCam：pGR106瞬时表达载体，借助菌落PCR扩增从转化的大肠杆菌DH5α菌落中鉴定阳性克隆，并进行测序验证，分别获得夏侧金盏花、雨生红球藻和红发夫酵母的虾青素合成酶表達载体pCam：pGR106-Aa、pCam：pGR106-Hp和pCam：pGR106-Xd，其PCR扩增鉴定引物分别为：5'-ATGGCTGCTATTTCCGTGTTCTC-3'和5'-TAA TAGCTGGCACGTTAGCA-3';5'-ATGCATGTTGCT TCCGCTCTCAT-3'和5'-GCCTTGTGAGCGTACCT AGC-3'以及5'-ATGTTCATCCTTGTGCTTCTTAC-

3'和5'-CTCAACTGGCTTCACCTGAAGCC-3'。

通过液氮冻融法将上述瞬时表达载体分别转入农杆菌GV3101，借助菌落PCR扩增鉴定阳性克隆。将得到的阳性菌落接种至5 mL含有50 mg/mL卡那霉素和50 mg/mL利福平的YEB培养基，振荡培养24 h后;取100 μL菌液接种至50 mL含50 mg/mL卡那霉素、50 mg/mL利福平和20 μmol/L乙酰丁香酮的YEB培养基，过夜振荡培养。然后，离心收集菌体，重新悬浮于含10 mmol/L MES-KOH （pH 5.5）、10 mmol/L MgCl2和100 μmol/L乙酰丁香酮的悬浮液，至OD600=0.8，室温静置诱导3 h，并用注射器将菌液注入烟草叶片内，将注射叶片用保鲜膜包裹，置于室内培养间培养。2 d后，揭去保鲜膜，继续培养4～6周，并在此期间观察注射叶片及位于其上部的叶片中虾青素的合成情况。

1.5  稳定表达载体构建及试验方法

为检验瞬时表达试验的结果可靠性，构建了上述不同真核生物源虾青素合成酶基因的稳定表达载体。将上述以2A肽段序列串联的酮基化酶和羟基化酶基因序列片段通过限制性内切位点Sac II和Asc I克隆入pENTR-D-Top载体，鉴定出阳性克隆后，将其质粒通过Gateway克隆方法在LR Clonase® II重组酶作用下与pBin19-attR载体重组，并鉴定阳性克隆，分别获得夏侧金盏花、雨生红球藻和红发夫酵母的虾青素合成酶表达载体pBin19-Aa、pBin19-Hp和pBin19-Xd，其PCR扩增鉴定引物分别为5'-ATGGCTGCTATTTCCGTGTTCTC-3'和5'-

CTGCTTCATGATGAAGTTGATGG-3';5'-ATGCAT GTTGCTTCCGCTCTCAT-3'和5'-ACGCTTGGA

CCAATCCAACTCCA-3'以及5'-ATGTTCATCCTTG

TGCTTCTTAC-3'和5'-CTCAACTGGCTTCACCT GAAGCC-3'。

通过液氮冻融法将上述瞬时表达载体分别转入农杆菌LBA4404，借助菌落PCR扩增鉴定阳性克隆。将得到的阳性菌落接种至5 mL含有50 mg/mL卡那霉素和50 mg/mL利福平的YEB培养基，

振荡培养48 h后;取500 μL菌液接种至50 mL含50 mg/mL卡那霉素、50 mg/mL利福平的YEB培养基，过夜振荡培养。然后，离心收集菌体，用新鲜YEB培养基重新悬浮后，侵染剪为1cm×1cm的无菌烟草叶片;7 min后除去菌液，将侵染叶片转移至MS固体培养基上于暗中培养2 d;然后，转移至含1 mg/mL 6-BA、250 mg/mL头孢和50 mg/mL卡那霉素的MS固体培养基上，于光周期为14 h光照/10 h黑暗的25 ℃温室培养，直至获得转基因愈伤及再生苗，并观察愈伤及再生苗的虾青素合成情况。

1.6  瞬时及稳定表达材料中的虾青素合成酶基因表达鉴定

分别取瞬时及稳定表达材料0.2 g，用Trizol试剂提取总RNA，并用随机引物做反转录引物，将总RNA反转录为cDNA，然后，分别用夏侧金盏花、雨生红球藻和红发夫酵母的虾青素合成酶基因特异引物，检测基因表达情况。肌动蛋白基因Actin作为表达分析的内参基因。取样时，瞬时表达材料在注射2周后取样，剪取注射部位叶片;稳定表达材料，取抗性愈伤及再生苗。表1所示为基因的表达鉴定引物序列。

1.7  虾青素的提取与测定

取瞬时或稳定表达虾青素合成酶的新鲜材料0.5 g，液氮充分研磨后加入2 mL丙酮进行色素提取，于7800 r/min离心后取上清液，以相同体积丙酮对样品重复提取3次后，合并上清液并定容至10 mL。取2 mL在暗中于稳定氮气流下将丙酮蒸干后，用微量氯仿溶解样品粉末，再以甲醇稀释至1 mL，经孔径0.22 μm的尼龙66微孔滤膜过滤后取10 μL进行超高效液相色谱（ACQUITY UPLC，Waters）检测。进行UPLC检测时，以虾青素标准品做参照，所用色谱柱为Waters公司的BEH C18 色谱柱（1.6 µm， 2.1 mm×50 mm），色谱柱温度为35 ℃，用流速为0.3 mL/min的水-乙腈梯度流动相进行样品分离，检测波长为465 nm。表2所示为水-乙腈梯度流动相的组成。

2  结  果

2.1  不同真核生物源虾青素合成酶基因的瞬时表达载体构建

通过全基因合成获得以2A肽段串联的不同真核生物源虾青素合成酶（含酮基化酶和羟基化酶）DNA片段后，通过限制性内切酶Sca I和Asc I克隆至瞬时表达载体pCam：pGR106，连接并转化大肠杆菌DH5α后，通过菌落PCR扩增进行了阳性克隆鉴定（图2），并进行了测序检测，分别获得夏侧金盏花、雨生红球藻和红发夫酵母的虾青素合成酶瞬时表达载体pCam：pGR106-Aa、pCam：pGR106-Hp和pCam：pGR106-Xd。

2.2  不同真核生物源虾青素合成酶的烟草瞬时表达分析

在叶片注射含瞬时表达目的载体农杆菌GV3101后，通过6周连续观察发现，含pCam：pGR106-Aa载体农杆菌的叶片注射部位在3～4周后会出现遍布注射部位的暗红色斑点，但与叶片的色差并不明显（图3A），植株上部的非注射叶片在6周后会出现一些散布的红褐色斑块（图3A）。而注射含空载体pCam：pGR106农杆菌的叶片注射部位未观察到任何红色斑点出现，植株上部的非注射叶片在后期会出现一些散布的花叶斑块，但无任何红色斑点（图3A）。此外，注射含表達载体pCam：pGR106-Hp或pCam：pGR106-Xd农杆菌的植株叶片也未观察到任何红色斑点出现。

同时，以注射4周后的叶片注射部位为材料，提取了总RNA，并通过反转录PCR（RT-PCR）检测了不同真核生物源虾青素合成酶基因的表达情况，结果显示所有目的基因都得到了不同程度的表达（图3B）。

以这些结果推测，来源于夏侧金盏花的虾青素合成酶在烟草内合成虾青素的活性要高于来源于雨生红球藻和红发夫酵母的虾青素合成酶。上述试验也表明，瞬时试验所观察到的现象不够明显，所能获得的可检测材料有限。为进一步揭示不同真核生物源虾青素合成酶在烟草中的生物活性差异，进行了稳定表达分析。

2.3  不同真核生物源虾青素合成酶基因的稳定表达载体构建

将上述以2A肽段串联的不同真核生物源虾青素合成酶（含酮基化酶和羟基化酶）DNA片段通过限制性内切位点Sac II和Asc I克隆入pENTR-D-

Top载体，连接并转化大肠杆菌DH5α后，通过菌落PCR扩增进行了阳性克隆鉴定（图4A），并测序检测获得目的克隆。随后，将阳性克隆质粒通过Gateway克隆方法在LR Clonase® II重组酶作用下与目的载体pBin19-attR-HA进行重组，转化大肠杆菌DH5α后，通过菌落PCR扩增进行了阳性克隆鉴定（图4B），并测序检测，分别获得夏侧金盏花、雨生红球藻和红发夫酵母的虾青素合成酶稳定表达载体pBin19-Aa、pBin19-Hp和pBin19-Xd。

2.4  不同真核生物源虾青素合成酶的烟草稳定表达分析

用含稳定表达目的载体的农杆菌LBA4404侵染烟草叶片后，通过4周培养发现，含表达载体pBin19-Aa农杆菌侵染的叶片分化出了红色愈伤组织，从红色愈伤组织发出的再生苗也呈红色（图5A），红色愈伤及再生苗发生的比例约占愈伤总数的2%。而含表达载体pBin19-Hp农杆菌侵染的叶片可分化出淡红色愈伤组织，但从淡红色愈伤组织发出的再生苗均为绿色（图5A），淡红色愈伤发生的比例约占愈伤总数的1%。然而，含表达载体pBin19-Xd农杆菌侵染的叶片，与含空载体农杆菌侵染的叶片类似，未能分化出红色愈伤组织或再生苗（图5A）。

隨后，将分化的抗性愈伤扩繁后，取样进行总RNA提取，并通过反转录PCR检测了不同真核生物源虾青素合成酶基因的表达情况，结果显示所有抗性愈伤都在不同程度上表达了目的基因（图5B）。

从稳定表达试验结果分析，来源于夏侧金盏花的虾青素合成酶在烟草内合成虾青素的活性最高，来源于雨生红球藻的虾青素合成酶的活性次之，但是未观察到红发夫酵母虾青素合成酶的活性。与瞬时表达试验相比，稳定表达试验对不同生物源虾青素合成酶在烟草中的生物活性观察更灵敏，更准确。

2.5  稳定表达材料的虾青素提取与检测

在获得不同生物源真核生物虾青素合成酶的稳定表达愈伤及再生苗后，从不同材料中取等量样

品进行了虾青素提取，并以虾青素标准品做参照，进行了超高效液相色谱分析。在虾青素标准品对应的保留时间处，表达夏侧金盏花虾青素合成酶的材料有一明显色谱峰，表达雨生红球藻虾青素合成酶的材料有一微弱色谱峰，而表达红发夫酵母虾青素合成酶的材料无明显色谱峰（图6）。这一结果与稳定表达材料的愈伤及再生苗中观察到的现象一致，证明夏侧金盏花的虾青素合成酶在烟草内活性最高，雨生红球藻的虾青素合成酶活性次之，而红发夫酵母的虾青素合成酶活性未能检出。

3  讨  论

如前所述，自然界中仅数量有限的细菌、真菌、藻类和植物等有机体具有天然虾青素的从头合成能力[5]，不同生物的虾青素合成酶在分子结构及作用方式上存在极大差异[11，15-21]。本研究系统分析了自然界中具有虾青素从头合成能力的真菌、藻类和植物中的虾青素合成酶在烟草中合成虾青素的生物活性差异，有助于揭示不同真核生物源虾青素合成酶在烟草中的异源表达生物活性特征，同时，可为虾青素烟草生物反应器的开发提供关键的分子基础。

通过对分别来源于夏侧金盏花、雨生红球藻和红发夫酵母的虾青素合成酶在烟草中瞬时表达和稳定表达后的虾青素合成活性研究，两种试验结果都表明来源于夏侧金盏花的虾青素合成酶在烟草中合成虾青素的活性最高。但仅有稳定表达试验能够区别来源于雨生红球藻和红发夫酵母的虾青素合成酶在烟草中的虾青素合成活性差异。这些试验结果在一定程度上反映出稳定表达试验对不同生物源虾青素合成酶在烟草中的生物活性检测要比瞬时试验更灵敏，更准确。造成瞬时表达试验不易检测低活性虾青素合成酶生物活性的原因可能与病毒介导的表达方式有关，也可能与不同生物来源虾青素合成酶在烟草中的作用方式差异有关。

尽管夏侧金盏花、雨生红球藻和红发夫酵母3种来源的虾青素合成酶在烟草中合成虾青素的活性存在极大差异，但表达分析显示这些基因都能在烟草中得到表达。推测导致生物活性差异的原因有两个：一是不同来源虾青素合成酶在烟草中的作用方式差异，二是其蛋白水平的调控差异，这在一定程度上反映出虾青素合成酶生物活性调控的复杂性。未来的虾青素烟草生物反应器研究工作不仅要加强适于烟草的虾青素合成酶来源研究，同时，也要加强虾青素合成酶在烟草中的生物作用机制研究，并在此基础上开展蛋白水平的结构优化，进一步提高其在烟草内的生物活性，以期获得更加高效的虾青素烟草生物反应器。

4  结  论

通过对植物的夏侧金盏花、藻类的雨生红球藻及真菌的红发夫酵母等3种真核生物源虾青素合成酶在烟草中的生物活性比较研究，证明植物夏侧金盏花的虾青素合成酶在烟草中合成虾青素的活性

最高，是虾青素烟草生物反应器开发中最具潜力的真核生物源虾青素合成酶。

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