PPARδ基因多态性与大动脉粥样硬化型脑梗死关系

李鹏飞 常飞 刘丽媛 崔宝龙 何晓燕 周畅

[摘要] 目的 探討过氧化物酶体增殖物激活受体δ（PPARδ）基因多态性与大动脉粥样硬化（LAA）型脑梗死的关系。

方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术（PCR-RFLP）检测270例山东汉族LAA型脑梗死病人及236例同期健康体检者（对照组）PPARδ基因rs9794和rs2267668位点的基因型，采用Logistic回归模型分析PPARδ基因多态性与LAA型脑梗死的关系。

结果脑梗死组和对照组rs9794位点的GG/GC基因型频率分别为30.37%（82/270）和44.07%（104/236），G等位基因频率分别为17.59%（95/540）和24.15%（114/472），脑梗死组rs9794位点的GG/GC基因型及G等位基因频率明显低于对照组（OR=0.554，95%CI=0.384～0.798，P<0.05;OR=0.670，95%CI=0.494～0.910，P<0.05）;两组rs2267668位点基因型及等位基因频率比较差异无统计学意义（P>0.05）。多因素Logistic回归分析显示，PPARδ基因rs9794位点的GG/GC基因型是LAA型脑梗死的保护因素（OR=0.616，95%CI=0.407～0.932，P<0.05）;rs9794和rs2267668位点多态性与LAA型脑梗死病人血管狭窄部位无关（P>0.05）;不吸烟（OR=0.538，95%CI=0.348～0.832，P<0.05）、无高血压史（OR=0.328，95%CI=0.181～0.595，P<0.05）、无糖尿病史（OR=0.528，95%CI=0.332～0.841，P<0.05）、无冠心病史（OR=0.418，95%CI=0.279～0.627，P<0.05）人群PPARδ基因rs9794位点GG/GC基因型者发生LAA型脑梗死的危险性明显降低。

结论 PPARδ基因rs9794位点G等位基因降低了LAA型脑梗死的易感性，在脑梗死的发生发展中可能是保护因素;吸烟史、高血压史、糖尿病史和冠心病史等传统危险因素减弱了rs9794位点GG/GC基因型对脑梗死的保护作用。

[关键词] 脑梗死;动脉粥样硬化;过氧化物酶体增殖物激活受体;多态性，单核苷酸

[中图分类号] R743.33

[文献标志码] A

[文章编号]  2096-5532（2019）01-0076-06

ASSOCIATION BETWEEN PEROXISOME PROLIFERATOR-ACTIVATED RECEPTOR Δ GENE POLYMORPHISM AND LARGE-ARTERY ATHEROSCLEROTIC CEREBRAL INFARCTION

LI Pengfei， CHANG Fei， LIU Liyuan， CUI Baolong， HE Xiaoyan， ZHOU Chang

（Department of Neurology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the association between peroxisome proliferator activated receptor δ （PPARδ） gene polymorphism and large-artery atherosclerotic （LAA） cerebral infarction.

MethodsA total of 270 Chinese Han patients in Shandong， China， who were diagnosed with LAA cerebral infarction （cerebral infarction group） and 236 healthy individuals who underwent physical examination during the same period （control group） were enrolled， and polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism was used to determine the genotypes of rs9794 and rs2267668 of the PPARδ gene. A logistic regression model analysis was used to investigate the association between PPARδ gene polymorphisms and LAA cerebral infarction.

ResultsCompared with the control group， the cerebral infarction group had significantly lower GG/GC genotype and G allele frequencies of rs9794 GG/GC genotype：30.37% （82/270） vs 44.07% （104/236）， （OR=0.554，95%CI=0.384-0.798，P<0.05）; G allele：17.59% （95/540） vs 24.15% （114/472）， （OR=0.670，95%CI=0.494-0.910，P<0.05）. There were no significant diffe-rences in the genotype and allele frequencies of rs2267668 between the two groups （P>0.05）. The multivariate logistic regression analysis showed that GG/GC genotype of rs9794 of the PPARδ gene was a protective factor against LAA cerebral infarction （OR=0.616，95%CI=0.407-0.932，P<0.05）. Polymorphisms of rs9794 and rs2267668 were not asso-ciated with the site of vascular stenosis in patients with LAA cerebral infarction. Among the people with GG/GC genotype of rs9794 of the PPARδ gene， the individuals who did not smoke （OR=0.538，95%CI=0.348-0.832，P<0.05） or had no history of hypertension （OR=0.328，95%CI=0.181-0.595，P<0.05）， diabetes （OR=0.528，95%CI=0.332-0.841，P<0.05）， or coronary heart disease （OR=0.418，95%CI=0.279-0.627，P<0.05） had a significant reduction in the risk of cerebral infarction.

ConclusionThe G allele of rs9794 of the PPARδ gene reduces the susceptibility to LAA cerebral infarction and may be a protective factor in the development and progression of cerebral infarction. The risk factors including the histories of smoking， hypertension， diabetes， and coronary heart disease weaken the protective effect of GG/GC genotype of rs9794 against cerebral infarction.

[KEY WORDS]brain infarction; atherosclerosis; peroxisome proliferator-activated receptors; polymorphism， single nucleotide

腦梗死是一种由环境因素、遗传因素及二者相互作用引起的复杂多因素疾病，而大动脉粥样硬化（LAA）型脑梗死是中国人群脑梗死的主要类型[1]。传统危险环境因素主要包括吸烟、高血压、糖尿病、血脂异常等。应用家族聚集性研究、双生子研究、家系的复合分离分析和遗传模式分析等多种方法研究均显示，脑梗死符合多基因遗传模式[2]。近年来有关基因多态性对脑梗死的潜在影响已成为一个新的研究热点。流行病学调查研究显示，我国脑梗死病人颅内、外血管狭窄的发生率存在差异[3]。动脉粥样硬化是LAA型脑梗死的主要原因。研究认为动脉粥样硬化是一种血管的炎症性病理生理过程，其关键调节因子之一是转录因子核因子κB（NF-κB），NF-κB在动脉粥样硬化发生发展过程中起着重要作用[4]。过氧化物酶体增殖物激活受体δ（PPARδ）是一类核激素受体超家族的配体激活转录因子[5]，广泛分布于人体各种组织。在人类血管内皮细胞中，PPARδ具有减轻血管炎症反应的作用，其机制为通过阻断NF-κB核转位，抑制血管内皮细胞1、细胞间黏附分子1、单核细胞趋化蛋白1及生长调节致癌基因的表达，从而抑制肿瘤坏死因子α诱导的细胞黏附及炎症反应[6]。14-3-3ε是内皮细胞抗凋亡机制的重要组成部分，对于维持血管壁的稳态极其重要，而PPARδ可通过上调人内皮细胞14-3-3ε表达发挥抗动脉粥样硬化作用[7]。近来已有研究表明，PPARδ基因rs9794位点能够降低血胆固醇水平[8]，PPARδ基因rs2267668位点与中国汉族2型糖尿病易感性无关[9]。但是国内外对上述基因位点多态性与LAA型脑梗死的关联研究鲜有报道，故本研究对此进行了探讨。

1 资料和方法

1.1 研究对象

①脑梗死组：为2016年8月—2017年6月在我科住院治疗的270例脑梗死病人，其诊断均符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南》中脑梗死的诊断标准[10]，均经颅脑CT或颅脑MRI检查证实。根据TOAST标准[11]，均为LAA型脑梗死。排除标准：小动脉闭塞性、心源性及其他原因脑梗死;并发严重外伤或感染性疾病;恶性肿瘤或自身免疫性疾病等。根据颅脑磁共振血管成像（MRA）或颅脑CT血管成像（CTA）确定的脑血管狭窄部位，分为颅内组、颅外组、颅内外组3个亚组。②对照组：为同期我院体检中心的236例健康体检者。本研究获青岛大学附属医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1基本资料采集 通过临床问卷调查及体格检查采集所有研究对象的基本资料，如年龄、性别、身高、体质量、吸烟史、饮酒史等，并计算体质量指数（BMI）和腰臀比。所有受试者禁食12 h，晨起常规采血检测血糖、总胆固醇、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）及低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）等生化指标。

1.2.2危险因素定义 ①高血压：未口服药物时收缩压≥18.62 kPa和（或）舒张压≥11.97 kPa，或使用降压药物;②糖尿病：空腹血糖≥7.0 mmol/L和（或）餐后血糖≥11.1 mmol/L，或使用降糖药物;③冠心病：经心电图或冠状动脉检查确诊;④吸烟史：连续或累计吸烟6个月以上，数量每天≥10支;⑤饮酒史：饮酒时间≥5年，摄入乙醇量≥40 g/d;⑥家族史：受试对象一级亲属和（或）二级亲属至少有1例脑梗死病人。

1.2.3血液DNA提取 采集研究对象肘静脉血2 mL，加入含有已二胺四乙酸二钠的真空采血管中，充分混匀防止凝集。于当日使用血液DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司提供）提取血液白细胞中的DNA。

1.2.4PPARδ基因多态性分析 两位点均采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术（PCR-RFLP）进行分析，引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成，引物序列见表1。PCR反应体系25.0 μL，内含有模板DNA 2.0 μL，上下游引物各1.0 μL，2×Taq PCR Mastermix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s，两个位点褪火条件分别为67 ℃、30 s，65 ℃、30 s，72 ℃延伸30 s，进行35次循环。取扩增产物5 μL，采用琼脂糖凝胶电泳成像，检查PCR产物特异性。

1.2.5基因型鉴定 酶切反应体系25.0 μL：PCR扩增产物4.0 μL，限制性内切酶（rs9794位点内切酶PshAⅠ和rs2267668位点内切酶HPY188Ⅰ，美国NEB公司）1.0 μL，10×NE Buffer 2.5 μL，双蒸

水17.5 μL。反应条件如下：rs9794、rs2267668位点分别为65、37 ℃置于恒温金属浴1 h。取酶切产物10 μL，GelRed染色，在20 g/L琼脂糖凝胶上电泳（100 V、40 min），使用凝胶成像分析仪观察并照相。同时取10%受试者的PCR扩增产物进行DNA测序，验证PCR扩增及酶切结果。

1.3 统计学方法

使用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。计量资料符合正态分布者以[AKx-D]±s表示，两组之间比较采用两独立样本t检验，多组之间比较采用单因素方差分析;计量资料不符合正态分布者以中位数（四分位数间距）表示，多组之间比较采用Kruskal-Wallls H检验。計数资料组间比较采用χ2检验。采用多项Logistic回归分析检验各因素与脑梗死的关系。以P<0.05为差异有显著性。

2 结  果

2.1 两组基本临床资料比较

两组冠心病史、高血压史、2型糖尿病史、吸烟史、饮酒史、收缩压、舒张压、空腹血糖、LDL-C及HDL-C比较差异均具有统计学意义（χ2=5.462～35.685，t=2.885～6.933，H=5.534，P<0.05），而年龄、性别、家族史、TG、胆固醇、纤维蛋白原、BMI及腰臀比比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。脑梗死病人颅内、颅外和颅内外血管狭窄的发生率分别为33.70%、24.07%和42.22%。脑梗死组3个亚组间基本临床资料比较，颅内组和颅内外组空腹血糖、舒张压高于颅外组（H=7.745，F=3.492，P<0.05），其他指标差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.2 两组基因型和等位基因频率的比较

PPARδ基因两个位点的酶切电泳基因分型见图1。脑梗死组、对照组及脑梗死各亚组PPARδ基因两个位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，在青岛地区具有人群代表性。脑梗死组rs9794位点的GG/CG基因型频率及G等位基因频率明显低于对照组，差异具有统计学意义（OR=0.554，95%CI=0.384～0.798，P<0.05;OR=0.670，95%CI=0.494～0.910，P<0.05），两组rs2267668位点基因型及等位基因频率比较差异无显著意义（OR=0.767，95%CI=0.534～1.102，P>0.05;OR=0.896，95%CI=0.661～1.217，P>0.05）。见表4、5。多项Logistic回归分析的结果显示，高血压史、糖尿病史、冠心病史、吸烟史、收缩压以及LDL-C是LAA型脑梗死的危险因素，而HDL-C和

rs9794位点GG/GC基因型是LAA型脑梗死的保护因素。见表6。

2.3 PPARδ基因多态性与脑梗死血管狭窄部位的关系

PPARδ基因两个位点的基因型及等位基因频率在脑梗死组3个亚组间的分布差异无统计学意义（P>0.05）。见表7、8。

2.4PPARδ基因rs9794位点多态性分层分析

对差异有统计学意义的rs9794位点进一步进行分层分析，结果显示，不吸烟（OR=0.538，95%CI=0.348～0.832，P<0.05）、无高血压史（OR=0.328，95%CI=0.181～0.595，P<0.05）、无糖尿病史（OR=0.528，95%CI=0.332～0.841，P<0.05）、无冠心病史（OR=0.418，95%CI=0.279～0.627，P<0.05）人群PPARδ基因rs9794位点GG/GC基因型者发生脑梗死的危险性明显降低。而在有吸烟史（OR=0.630，95%CI=0.318～1.260，P>0.05）、高血压史（OR=0.782，95%CI=0.464～1.317，P>0.05）、糖尿病史（OR=0.639，95%CI=0.331～1.235，P>0.05）、冠心病史（OR=2.844，95%CI=0.997～8.111，P>0.05）情况下，rs9794位点GG/GC基因型对脑梗死无明显保护作用。

3 讨  论

PPARδ基因位于染色体6P21.1-P21.2区域，共含有9个外显子，编码442个氨基酸[12]。研究表明，PPARδ激动剂可通过调控不同组织中脂质代谢、降低血脂水平，使肥胖和糖尿病动物模型的LDL和TG水平趋于正常[13]。IWASHITAA等[14]报道，PPARδ基因敲除小鼠局部脑缺血导致的脑梗死面积较野生型小鼠大，表明PPARδ在脑缺血早期具有保护中枢神经的作用。YIN等[15]研究表明，PPARδ在缺血性损伤中可以发挥脑动脉血管保护作用。BENETTIE等[16]研究表明，PPARδ激动剂对诸如心肌梗死、脑梗死等疾病也产生有益作用。还有研究显示，PPARδ基因rs9794位点GG/GC基因型与血液中炎症标志物C-反应蛋白浓度降低有关[17]。LI等[18]研究表明，PPARδ基因rs974位点GG/GC基因型及G等位基因可能是原发性高血压的保护因素。但是目前尚缺乏PPARδ基因多态性与LAA型脑梗死的关联研究。

本文结果显示，脑梗死组PPARδ基因rs9794位点GG/GC基因型及G等位基因频率明显低于对照组，表明携带G等位基因能够明显降低LAA型脑梗死的发生风险。推测PPARδ基因rs9794多态性对脑梗死的保护作用可能涉及其抗动脉粥样硬化作用，但这还需进一步研究证实。

大动脉闭塞性疾病是世界范围内缺血性脑梗死的重要原因，但其闭塞部位在不同地区、人种之间存在明显差异，颅外血管狭窄引起的脑梗死在白色人种中更常见，而在亚洲人、黑人和西班牙裔脑梗死病人中颅内血管狭窄更常见[19]。在中国人群中，脑梗死病人颅内、外动脉狭窄的发生率分别为33%～67%和9.0%～24.1%[20]。本文结果显示，LAA型脑梗死病人颅内狭窄的发生率（33.7%）高于颅外狭窄发生率（24.1%），与以上研究结果相一致。另外，本研究还对PPARδ基因多态性与LAA型脑梗死病人脑血管狭窄部位的关系进行了探讨，结果显示PPARδ基因多态性与脑血管狭窄部位无关。

本研究还进一步探讨了环境因素和PPARδ基因rs9794位点GG/GC基因型相互作用对LAA型脑梗死的影响，结果显示，不吸烟、无高血压史、无糖尿病史、无冠心病史人群PPARδ基因rs9794位点GG/GC基因型者发生脑梗死的危险性明显降低。表明吸烟、高血压史、糖尿病史和冠心病史减弱了rs9794位点GG/GC基因型对脑梗死的保护作用。吸烟、糖尿病、高血压等传统危险环境因素均是通过介导血管壁的炎症反应加速动脉粥样硬化的进展，进而最终导致脑梗死的发生发展[21]。PPARδ基因可以通过参与调节NF-κB核转位、抑制血管炎症反应，发挥其抗动脉粥样硬化作用[4，6]。PPARδ基因rs9794位点GG/GC基因型和吸烟、高血压、糖尿病等傳统危险环境因素可能在共同参与动脉粥样硬化这一病理过程中产生了拮抗作用。因本研究结果受样本量、地区、人种等多因素的影响，所以有必要开展大样本量和不同种族、地区的研究，以进一步明确PPARδ基因多态性对中国人群脑梗死的影响。

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