传统煎法与现代煎药机制备三黄汤的高效液相色谱法指纹图谱

张丽 高岩

摘要 目的：探讨采用高效液相色谱法（HPLC）分析三黄汤传统煎法和现代煎药机法的指纹图谱差异。方法：选取10个不同批次的三黄汤配方，配制传统煎法三黄汤供试品溶液和现代煎药机三黄汤供试品溶液，色谱条件采用4.6 mm×250 mm的DIAMONSIL C18保护柱（5 μm），以30 ℃为柱温，进样量为15 μL，以甲醇为流动相A，1%磷酸水为流动相B，检测波长为277 nm，进行HPLC指纹图谱对比研究。结果：三黄汤专属性良好。线性关系考察显示黄芩苷回归方程Y=75.64X+21.31，r=0.999 8（n=5），黄芩苷对照品范围在0.5～12.0 μg/mL，线性考察结果显示线性关系良好。精密度结果最终取大于总峰面积5%的色谱峰相对峰面积RSD平均值1.776%，三黄汤供试品溶液精密度良好。稳定性结果显示色谱峰相对峰面积RSD平均值1.843%，三黄汤供试品溶液24 h内稳定性良好。重复性试验结果显示色谱峰相对峰面积RSD平均值1.911%，三黄汤的重复性良好。加样回收率检测结果显示平均回收率99.81%，RSD 1.79%，高相液相检测方法所测加样回收率结果可靠。样品测定结果显示在同一色谱洗脱梯度下，传统煎法的三黄汤指纹图谱120 min即完成检测，而现代煎药机法制备的三黄汤指纹图谱在131.87 min才完成检测;另外从图谱中可见现代煎药机制备的三黄汤中色谱峰更多，可能与现代煎药机的高压煎煮设备能析出更多共有峰有关。从各自的指纹图谱相似度中可得，10批传统煎法三黄汤的相似度和10批现代煎药機法三黄汤的相似度均高于0.9，其中传统煎法平均相似度为0.971 4，现代煎药机法平均相似度为0.981 6，略高于传统煎法。结论：传统煎法和现代煎药机法制备的三黄汤的HPLC指纹图谱存在一定差异。

关键词 高效液相色谱法;指纹图谱;三黄汤;传统煎法;现代煎药机;高压;精密度;重复性

Abstract Objective：To compare the fingerprints of traditional decocting method and modern decocting machine methods of Sanhuang Decoction by high performance liquid chromatography（HPLC）.Methods：Ten different batches of Sanhuang Decoction were randomly selected by random digital table method to prepare Sanhuang decoction solution of traditional decocting method and Sanhuang Decoction solution of modern decocting machine.The chromatographic conditions were as follows：DIAMONSIL C18 protective column（5 μm）of 4.6 mm×250 mm，column temperature 30 ℃，injection volume 15 μL，methyl alcohol as mobile phase A and 1% phosphoric acid water as mobile phase B，detection wavelength of 277 nm，for HPLC fingerprint comparison.Results：1）The specificity of Sanhuang Decoction was tested by HPLC.The results showed that the specificity of Sanhuang Decoction was good. 2） Linear relationship test showed that the regression equation of baicalin y=75.64X+21.31，r=0.999 8（n=5）.The results showed that the range of baicalin reference substance was 0.5～12.0 ug/mL，and the linear relationship was good. 3）The RSD average value of relative retention time of chromatographic peaks larger than 5% of the total peak area was 1.776%.The results showed that the solution of Sanhuang Decoction had good precision. 4）The results of stability showed that the RSD value of relative retention time of chromatographic peaks was 1.843%，suggesting that the solution of Sanhuang Decoction had good stability within 24 hours. 5）The results of repeatability test showed that the RSD value of relative retention time of chromatographic peaks was 1.911%，suggesting that the repeatability of Sanhuang Decoction was good. 6）The average recovery was 99.81% and RSD was 1.79%.The results showed that the HPLC was reliable. 7）Sample determination results showed that under the same chromatographic elution gradient，the fingerprint of traditional decocting method of Sanhuang Decotion was completed within 120 minutes，and the fingerprint of modern decocting machine prepared Sanhuang Decotion was completed within 131.87 minutes; In addition，from the chromatogram，it can be seen that there were more chromatographic peaks in the modern decocting machine prepared Sanhuang Decoction，which may be compared with that more common peaks can be separated from the high pressure decocting equipment of the modern decocting machine.From the similarity of fingerprints，the similarity of 10 batches of Sanhuang Decoction prepared by traditional decocting method and 10 batches of Sanhuang Decoction prepared by modern decocting machine method were higher than 0.9，of which the average similarity of traditional decocting method was 0.9714，and that of modern decocting machine method was 0.9816，slightly higher than that of traditional decocting method.Conclusion：The HPLC fingerprint of Sanhuang Decoction prepared by traditional decocting method and modern decocting machine method is different.

Key Words High performance liquid chromatography; Fingerprint; Sanhuang Decoction; Traditional decocting method; Modern decocting machine method; High pressure; Precision; Repeatability

中图分类号：R284 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.10.010

中医中药是我国历史悠久的传统医学文化瑰宝，利用中药制备的汤剂来治疗相应的疾病源远流长，早在商朝的伊尹时期就可见相关记载[1-4]。因其中药组方灵活，可根据中医辨证论治的特点，对不同的患者和疾病证候进行随证加减，故而治疗效果确切，不良反应较少，而且使用时煎煮方便，吸收起效迅速，从而受到历代医家的广泛使用，是中医学从古延续至今重要的治疗方法之一[5]。然而，随着现代社会的不断发展，生活工作节奏的加快，传统中药煎剂也面临着一定的问题[6]。部分患者认为传统煎煮中药的方法用时过长，且对药物先下、后入等操作不明，故而临床用药选择时对传统煎剂的倾向性不高[7]，这也成为中药制剂现代发展的一个制约[8]。中药煎药机的出现则为中药煎剂的改良提出了另外一种可能，但由于现代煎药机煎煮模式与传统煎法存在较大差异[9]，且目前临床研究中尚缺乏对二者之间的差异进行全面、系统、客观的有效性评估，故部分医师及患者对煎药机制备药剂的使用效果仍存有疑虑[10-11]。在明代的《本草纲目》中也提到：“煎药者，水火不良，火候失度，则药亦无功”。也明确的提出了煎药方法及其质量的好坏能够极大的影响药物的疗效。本研究通过高效液相色谱法（HPLC）指纹图谱选择以三黄汤为研究对象，比较使用传统煎药法与现代煎药机煎药2种不同制备手段所制的三黄汤煎剂之间的差异，从而对其差异及药物的有效性进行探讨和分析，以期为临床的药物使用提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪（型号：LC-20AT）购于日本岛津公司、二元泵（型号：LC-20AT泵）购于日本岛津公司等;高端型超纯水机（型号：ULUP）购于杜伯特（北京）科技有限公司;数控超声清洗器（型号：KQ50）购于昆山市超声仪器有限公司。

1.2 试剂 于上海信跃化学品有限公司购买色谱乙腈、色谱甲醇、磷酸分析纯、冰醋酸分析纯等;甲酸分析纯购于东莞市聚鹏化学有限公司;中国食品药品检定研究院提供的对照品：黄芩苷（批号：110715-200212）。

1.3 分析样品 三黄汤的药方根据古方剂量，炙大黄（批号：20121201）、黄芩（批号：20121001）、黄柏（批号：20121014）、甘草（批号：20121013），均购自广东省药材公司中药饮片厂，三黄汤随机抽取10个不同批次。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用4.6 mm×250 mm的DIAMONSIL C18保护柱（5 μm），以30 ℃为柱温，无论是供试品溶液还是对照品溶液均在进样前以流动相梯度初始条件平衡30 min，进样量为15 μL，以甲醇為流动相A，1%磷酸水为流动相B，具体梯度洗脱程序见表1，检测波长为277 nm。

2.2 对照品溶液的制备 首先精密称取12.46 mg黄芩苷对照品，然后将其放置于60 ℃真空干燥，接着将干燥物转入广口瓶中并加70%甲醇定容至25 mL，经超声重复溶解均匀，制成0.028 mg/mL的黄芩苷对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 传统煎法供试品溶液制备 根据三黄汤配伍比例，取除大黄外的全部3味药加10倍量蒸馏水浸泡30 min，煎煮方法采用传统煎法加热煮沸10 min后，转小火煮40 min，加入炙大黄继续煎煮10 min，以0.45 μm微孔滤膜过滤，过滤液密封保存;剩余药渣再加8倍量蒸馏水，煎煮方法同第1次，并以0.45 μm微孔滤膜过滤，合并2次过滤液后进行浓缩，定容至2.80 g/ mL的三黄汤水煎液。精密量取0.2 mL三黄汤水煎液于10 mL量瓶中并以50%的甲醇定容，充分混合均匀后以0.45 μm微孔滤膜滤过，即得传统煎法供试品溶液。

2.3.2 现代药煎机法供试品溶液制备 根据三黄汤配伍比例，取全部3味药加10倍量蒸馏水浸泡30 min，加入炙大黄后直接采用现代煎药机（高压）法加热60 min后，煎煮所得药液以0.45 μm微孔滤膜过滤并密封保存;剩余药渣再加8倍量蒸馏水，以相同的现代煎药机煎煮相同时长，第2次煎煮所得药液以0.45 μm微孔滤膜过滤，合并2次过滤液，浓缩，定容至2.80 g/ mL的三黄汤水煎液。精密量取0.2 mL三黄汤水煎液于10 mL量瓶中并以50%的甲醇定容，充分混合均匀后0.45 μm微孔滤膜滤过，即得现代煎药机法供试品溶液。

2.4 专属性试验 取同一供试品溶液根据2.3制备的供试品溶液进行专属性试验，结果显示三黄汤专属性良好。

2.5 线性关系考察 精密量取黄芩苷对照品溶液2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μL，根据2.1色谱条件进行HPLC色谱法检测，记录峰面积;以峰面积积分值为纵坐标（Y），对照品进样量（μg）为横坐标（X），绘制标准曲线，黄芩苷回归方程Y=75.64X+21.31，r=0.999 8（n=5），结果表明，黄芩苷对照品范围在0.5～12.0 μg/mL，线性考察结果显示线性关系良好。

2.6 精密度试验 精密取同一2.3制备的供试品溶液，在一组相同的测量程序、相同测试地点和相同的色谱条件等情况下，连续重复测量5次HPLC检测，且各色谱峰相对峰面积的RSD<3%，精密度结果最终取大于总峰面积5%的色谱峰相对峰面积RSD平均值1.776%，研究结果显示三黄汤供试品溶液精密度良好。

2.7 稳定性试验 由于固定相的有限稳定性，为确保每一次研究之间的结果误差最小，进行指纹图谱对比研究之前，取同一供试品溶液以确定供试品溶液的稳定性，分别室温放置0、4、8、12、16、24 h后进行HPLC检测，各色谱峰相对峰面积的RSD<3%则说明稳定性良好。本研究稳定性结果显示色谱峰相对峰面积RSD平均值1.843%。见表3。提示三黄汤供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验 为确保研究的客观性，进行指纹图谱对比研究之前，需要进行短时间内的HPLC连续重复性测试，精密量取6份同一供试品溶液，连续进样，各色谱峰相对峰面积的RSD<3%表示重复性良好。本研究结果显示色谱峰相对峰面积RSD平均值1.911%。见表4。提示三黄汤的重复性良好。

2.9 回收率试验 精密吸取已知含量的三黄汤供试品溶液6份，加入已知浓度的黄芩苷对照品溶液，混合均匀后水浴蒸干，残渣放入10 mL容量瓶中，加70%甲醇定容，进行加样回收试验的检测，根据2.1的色谱条件进行检测并计算加样回收率。结果显示平均回收率99.81%，RSD 1.79%，提示高相液相检测方法所测加样回收率结果可靠。

2.10 样品测定结果 由图1和图2的指纹图谱中可见三黄汤传统煎法和现代煎药机法的指纹图谱存在一定的差异，在同一色谱洗脱梯度下，传统煎法的三黄汤指纹图谱120 min即完成检测，而现代煎药机法制备的三黄汤指纹图谱在131.87 min才完成检测;另外从图谱中可见现代煎药机制备的三黄汤中色谱峰更多，可能与现代煎药机的高压煎煮设备能析出更多共有峰有关。从各自的指纹图谱相似度中和表5可得，10批传统煎法三黄汤的相似度和10批现代煎药机法三黄汤的相似度均高于0.9，其中传统煎法平均相似度为0.971 4，现代煎药机法平均相似度为0.981 6，略高于传统煎法。

3 讨论

使用煎法对中药进行加工从而制成汤剂用以治疗疾病在我国已有数千年的历史，最早可追溯至商代伊尹，“伊尹以亚圣之才，撰用神农本草以为汤液”。千年以来汤剂均为中医治疗的主要手段之一，如《备急千金要方》中云：“凡古方治疾，全用汤法……”。《圣济经》中云：“汤液主治，本乎腠理，凡涤除邪气者，用汤最宜”。由此可见汤剂在中医学历史中占据着十分重要的地位。历代医家对中药的煎制方法也均十分重视，李时珍认为：“凡服汤药，虽品物专精，修治如法……火候失度，则药亦无功”。徐灵胎在《医学源流论》曾云：“煎药之法，最宜深讲，药之效不效，全在乎此”。说明古人对煎药已有较多认识，并认为煎煮质量的好坏将极大影响药物的疗效。汉代张仲景曾将煎煮中药的用水分为雨水、千扬水等，同时对药物的各种煎煮方法进行了详细的记载，但到了现代，由于生活节奏的加快，传统煎药方法逐渐被现代煎药机所取代。相对于传统方法，自动煎药机具有其无可忽视的优势。现代煎药机煎煮的时间较短、使用参数客观，煎煮的过程保持密闭，安全卫生，同时有效地减少煎煮人员的工作量[12-13]。

传统煎煮方法与现代煎药机煎煮中药原则上都使用纯蒸馏水。有研究表明，中药煎煮的加水量一般根据中药饮片的质地、煎出物的溶解性来决定，花、叶、全草等质地松散，加水量一般较大，根茎、矿物、贝壳等质地坚硬，加水量较小，一般加水量为所用中药饮片重量的4～10倍[14-16]。而理论上最佳煎煮加水量为中药饮片的吸水量加上煎煮时的蒸发量及患者所需服用的药液量之和。然而在实际煎煮操作过程中，加水量精确仍存在一定困难[17]。本研究最后综合考量饮片煎煮的加水理论量、药物成分析出的平衡浓度、患者及煎药室使用的实际情况，最终选择三黄汤的传统煎法的加水量为药量10倍蒸馏水浸泡30 min，加热煮沸10 min后，转小火煮40 min，加入炙大黄继续煎煮10 min，第2次则以8倍蒸馏水量继续煎煮1次。现代煎药机煎药水量为10倍药物重量浸泡30 min，连续煎煮2次，每次煎煮时间为60 min。

本研究中使用HPLC对不同制备方法的三黄汤进行指纹图谱的对比鉴别，从而对传统煎药和现代煎药机制备出的汤剂进行质量评价。其中三黄汤的药物组成包括炙大黄、黄芩、黄柏、甘草，故而三黄汤组方中的有效药物成分较多。若各有效成分不具有专属性，则在其他药物干扰的情况下，对后续其他药物的成分含量检测时，就会因为各个药物间有效成分的相互影响，使实验结果出现偏倚[18-19]。故而在综合考量了HPLC的稳定性、重复性、精密性、回收率和线性考察的方法严谨性基础之上[20]，对HPLC的最佳色谱条件进行调试。本研究结果显示三黄汤的专属性良好，提示HPLC指纹图谱是一种具有灵敏性高、稳定性佳、重复性好、专属性强且十分简便的研究方法。

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（2018-09-13收稿 责任编辑：杨觉雄）