湖羊NR5A1基因全序列克隆和表达特征分析

李隐侠 张俊 钱勇 孟春花 王慧利 曹少先 仲跻峰

摘要：以江苏特色绵羊品种——湖羊为研究对象，克隆湖羊NR5A1基因全序列，分析其序列特征，并对湖羊组织和大、小卵泡中NRSAJ表达特征进行研究。结果表明，湖羊NRSAJ基因全长19 016 bp，含6个外显子和5个内含子;编码区全长1 386 bp，编码461个氨基酸残基，包含经典的DNA结合区（DBD）和配体结合区（IJBD）。RT-PcR结果显示NR5A1基因在湖羊组织中广泛表达，其中在卵巢中高表达，脾脏次之;qRT-PcR和westem b10t结果显示在湖羊大卵泡中NR5A1 mRNA和蛋白质水平均显著高于小卵泡，表明NRSA1基因参与调控湖羊卵泡发育，并与繁殖性能有关。

关键词：湖羊;NR5A1基因;序列特征;表达

中图分类号：s826.3 文献标识码：A 文章编号：1000-4440（2019）01-0114-08

羊NR5A1基因的研究较少，仅本实验室前期在湖羊上进行了NR5A1基因多态性的筛选和鉴定，结果表明NR5A1内含子区多态性可以作为分子标记筛选高繁殖力绵羊，但是对于湖羊NR5A1基因序列特征、组织表达模式及其在卵泡中表达的研究并未涉及。本研究以湖羊为研究对象，通过PCR扩增和克隆测序方法克隆湖羊NR5A1基因全序列，分析其序列特征，鉴别其组织表达模式及其在湖羊不同级别卵泡中表达差异，以期更全面了解NR5A1基因，为更详尽探索其参与调控湖羊繁殖性能的分子机制提供一定的理论参考。

1材料与方法

1.1试验材料

从江苏省苏州市东山湖羊资源保种区挑选纯种湖羊母羊，屠宰后取其心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大肠、小肠、卵巢、子宫和肌肉组织于液氮中保存带回实验室，于70℃冰箱保存，提取DNA、RNA和蛋白质用于后续试验。用手术剪分离卵巢中卵泡，得到大卵泡（直径>5 mm）和小卵泡（直径<3 mm），于液氮中保存，提取RNA和蛋白质用于后续试验。

1.2 DNA和RNA的提取

全基因组DNA提取采用传统的苯酚一氯仿方法，RNA提取用RNA提取试剂盒（Bioteke，北京）。琼脂糖凝胶和Nandrop方法测定DNA和RNA完整性和浓度。

2.4湖羊NRSAl基因组织表达模式mRNA水平与湖羊繁殖性能的相关性

用RT-PCR方法检测NR5A1基因在湖羊10个组织中的表达模式，发现NR5A1基因在湖羊各个组织中均有表达，但是在卵巢组织中表达量最高，肾脏次之，其他组织中均低表达，肝脏组织中表达量最低（图5）。

2.5 NRSAl基因对湖羊卵泡发育的调控

用qRT-PCR方法检测NR5A1基因在湖羊大卵泡和小卵泡中的表达差异，发现NR5A1基因在湖羊大卵泡中的mRNA表达水平显著高于小卵泡（P<0.01）（图6A）。同时Western blot结果也显示在大卵泡中NR5A1蛋白质的表达量显著高于小卵泡（图6B）。说明NR5A1基因参与调控湖羊卵泡的发育。

3讨论

本研究通过克隆测序拼接得到湖羊NR5A1基因从翻译起始位点开始到翻译终止位点结束的全序列和编码区全序列。湖羊NR5A1基因全序列长度约19 kb，包含6个外显子和5个内含子。外显子/内含子边界符合剪接供体和受体的“GT-AG”规则，与其他哺乳动物一样。NR5A1基因CDS区长1 386 bp，编码461个氨基酸残基。根据在氨基酸206位谷氨酰胺残基的缺失与否，哺乳动物NR5A1蛋白质有461个和462个氨基酸残基2种类型。而湖羊NR5A1蛋白质属于在206位没有谷氨酰胺残基的类型，与人类和牛一样。通过序列比对分析发现湖羊NR5A1基因在哺乳动物中相对保守，其编码的氨基酸与人类和牛的NR5A1基因编码的氨基酸一致性分别为94.04%和98.94%。NR5A1蛋白质具有NR5A家族保守的结构域：①DNA结合域（DBD），由经典的cys2-cys2锌指和FTZ-F1反应元件组成，而NR5A家族与DNA结合的特异性就是由DBD结构域C末端26个氨基酸残基组成的Ftz-F1盒（Ftz-F1 box）所决定的;②配体结合域（LBD），通过与配体结合反式激活NR5A的靶基因。根据NR5A1蛋白质氨基酸序列构建的系统发育树聚类结果与经典分类学结果基本一致。正如其他哺乳动物一样，湖羊NR5A1蛋白质也包含典型的DNA结合区域和配体结合区域。因此，高度同源性和保守基序使我们相信湖羊NRSAl基因像其他哺乳动物一样具有相同的功能。

有报道指出NRSAl基因参与调控性腺和肾上腺发育以及类固醇激素生成，并且在维持雌性动物卵巢功能和繁殖方面发挥重要的作用。本研究主要关注NRSAl表达及其是否通过参与调控湖羊卵泡发育进而调控湖羊的繁殖性能。通过RT-PCR分析发现NR5A1基因在湖羊组织中广泛表达，但是在卵巢组织中的表达量最高，这与F～ender等研究结果一致。Jin等发现NR5A1主要在卵泡发育各个阶段的颗粒细胞和卵母细胞中表达，调控类固醇激素的产生进而调控卵泡发育。同时有研究结果显示NR5A1能与miR320共同作用阻断颗粒细胞增殖。miR-764-3p通过影响NR5A1mRNA穩定性阻断其表达进而抑制Cypl9al基因表达，从而调控小鼠卵巢颗粒细胞发育。Pelusi等研究发现NR5A1敲除小鼠卵巢发育不全，卵泡数量减少，且缺乏黄体，颗粒细胞特异性敲除NR5A1基因显著影响了卵巢中NR5A1基因靶基因的表达。本研究发现NPUAl基因在湖羊大卵泡中的表达量显著高于小卵泡，表明NRSAl基因参与调控湖羊卵泡的发育，推测其通过调控湖羊颗粒细胞功能参与调控湖羊的繁殖。