10份贵州常用玉米自交系丝黑穗病抗性鉴定及遗传多样性分析

谭康 李春红 杨梅 申涛 邱红波

摘要：【目的】对贵州常用玉米自交系进行丝黑穗病抗性鉴定、主要农艺性状评价及SSR遗传多样性分析，为贵州玉米的抗丝黑穗病基因挖掘及优质抗性种质资源创建提供参考依据。【方法】以10份贵州常用玉米自交系材料为研究对象，于2016—2017年分别在贵州安顺市平坝实验基地及贵阳市花溪区贵州大学鱼塘教学试验场进行丝黑穗病抗性鉴定;采用136对条带清晰、重复性好的SSR分子标记对供试材料进行PCR扩增检测，并运用POPGENE 32和NTSYS-2.10e进行遗传多样性和聚类分析。【结果】连续两年两地的玉米丝黑穗病抗性鉴定结果表明，自交系T32和齐319表现为稳定高抗，感病率为0;自交系J51和J106表现为高感，平均感病率分别为64.18%和48.62%，其余6个自交系表现为感病。10份贵州常用玉米自交系材料在贵州地区均能正常成熟，其中以T32的综合表现较突出，为贵州优势种质材料，J51、J106和双M9次之，齐319的表现相对较差。136对SSR分子标记从10份贵州常用玉米自交系材料中共检测到567个等位基因，平均为4.17个;Neis基因多样性指数（H）为0.180～0.500，平均为0.328;多态性信息量（PIC）为0.150～0.920，平均为0.656;多态性最好的SSR分子标记为umc1795。以相似系数0.658为界，10份贵州常用玉米自交系可划分为三大类：类群Ⅰ包括苏11、T32、S37和双M9，均具有熱带血缘;类群Ⅱ包括齐319、J106、HC、郑58和QL16，均具有温带血缘;类群Ⅲ为贵州地方种质J51。【结论】贵州常用玉米自交系材料具有较广泛的遗传基础，可满足玉米育种对亲本遗传差异的基本要求。尤其是自交系T32高抗玉米丝黑穗病且在贵州山区具有良好的适应性，为热带血缘Suwan选系，明显区别于改良Reid选系、先锋选系、美国杂交种选系及贵州地方种质，可优先用于贵州地区抗丝黑穗病基因发掘、杂交种改良及优良抗性种质资源创建。

关键词： 玉米;自交系;丝黑穗病;SSR分子标记;抗性鉴定;贵州

中图分类号： S513.024                             文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）11-2384-08

Identification of head smut resistance and analysis of genetic diversity of 10 commonly used maize inbred lines in Guizhou

TAN Kang， LI Chun-hong， YANG Mei， SHEN Tao， QIU Hong-bo*

（College of Agriculture， Guizhou University，Guiyang  550025， China）

Abstract：【Objective】To analyze the identification of head smut resistance， evaluation of main agronomic traits and analysis of SSR genetic diversity of common maize inbred lines in Guizhou， and to provide a reference basis for head smut resistance gene mining and breeding of high-quality resistance germplasm resources of maize in Guizhou. 【Method】Taking 10 copies of Guizhou common maize inbred lines as research objects， the resistance identification test for head smut was performed at the Pingba Experimental Base in Anshun， Guizhou， and the fish pond teaching experimental field of Guizhou University， Huaxi District， Guiyang from 2016 to 2017. A total of 136 pairs of SSR molecular markers with clear and reproducible bands were used for PCR amplification of test materials. Genetic diversity and cluster analysis were performed by POPGENE 32 and NTSYS-2.10e. 【Result】The identification of head smut resistance in two places for two consecutive years showed that inbred lines T32 and Qi 319 showed stable high resistance with a susceptibility rate of 0; inbred lines J51 and J106 showed high susceptibility with susceptibility rates of 64.18% and 48.62%， and the other six inbred lines showed susceptibility. The analysis of main agronomic traits showed that all of the tested materials could grow in Guizhou mountainous area， among which inbred line T32 was the best， followed by J51， J106 and Shuang M9， and Qi 319 was the worst. Genetic diversity analysis showed that 567 alleles were detected in 10 maize materials with 136 pairs of SSR markers， averaging 4.17 alleles， Neis gene diversity index（H） was 0.328 on average， ranging from 0.180 to 0.500. Polymorphism information quantity （PIC） was 0.656 on average， ranging from 0.150 to 0.920. The umc1795 polymorphism was the best SSR marker. Taking the similarity coefficient of 0.658 as the boundary， 10 copies of Guizhou common maize inbred lines could be divided into three major groups：Group I included Su 11， T32， S37 and Shuang M9， all of which had tropical genetics;group II included Qi 319， J106， HC， Zheng 58 and QL16，they had temperate zone gene-tics; and group III was Guizhou local germplasm J51. 【Conclusion】The common maize inbred line materials in Guizhou have a broad genetic basis， which can meet the basic requirements for genetic differences of parents in maize breeding;The inbred line T32 is highly resistant to maize head smut and has good adaptability in the mountainous areas of Guizhou. It is a tropical Suwan line， which is different from the improved Reid line， Pioneer line， American hybrid line and Guizhou local germplasm. It can be preferentially used for the identification of head smut resistance genes， improvement of hybrids and creation of excellent resistant germplasm resources in Guizhou.

Key words： maize; inbred lines; head smut; SSR molecular marker; resistance identification; Guizhou

0 引言

【研究意义】玉米在我国贵州已有300多年的种植历史，是贵州重要的口粮、饲料及轻工业原料（郭向阳等，2015）。玉米丝黑穗病是由丝轴黑粉菌[Sporisorium reilianum（Kühn） Landon et Full]引起的一种全球性玉米病害，也是我国春玉米主要病害之一（白金铠，1997），自1919年在我国东北首次报道以来，病情不断蔓延升级，在我国东北、西南、甘肃和山西等地相继暴发成灾（栗建枝等，2002;张文天和王保进，2002;贺字典等，2005;黄剑秋，2005），导致当地玉米产量锐减。培育和利用適宜本地种植的抗病品种是防治玉米丝黑穗病最根本和最有效的方法，而对玉米种质资源的丝黑穗病抗性鉴定及抗性种质挖掘和利用是抗病育种的关键。【前人研究进展】至今，国内外学者对玉米丝黑穗病抗性种质的鉴定累计达7000余份（马沛卿等，1997;宋淑云等，2000;高洁等，2006;郭满库等，2007），且鉴定结果显示大部分常用自交系感或高感丝黑穗病，即抗性种质资源严重匮乏（马秉元等，1997;王连生等，2001;王振华等，2004;孟剑等，2015）。有关贵州常用玉米种质的丝黑穗病抗性研究，刘红梅等（2006）、柏光晓等（2007）从500多份贵州省内保存的玉米种质资源中仅筛选出6份高抗材料，表明贵州地区抗丝黑穗病玉米种质资源也非常匮乏。SSR分子标记因具有单碱基高分辨率、可检测等位基因、所需DNA样本量少和重复性好等优点（Blair et al.，2011;周丽霞等，2017），已广泛应用于植物遗传多样性分析及种质资源鉴定等研究领域。胡萍等（2012）利用19对玉米SSR分子标记将108份贵州地方玉米种质分为五大类群，揭示了贵州地区玉米种质遗传基础较广泛，同时为地方种质合理利用提供了参考;石海春等（2014）采用形态标记和SSR分子标记分别对82份玉米自交系进行聚类分析，结果显示，形态标记将供试材料划分为六大类，而SSR分子标记将供试材料划分为七大类，通过与供试材料系谱来源进行对比分析，证实SSR分子标记在种质资源鉴定及遗传多样性分析方面具有绝对优势;李世风等（2016）采用全自动DNA分析仪荧光SSR-PCR技术，以模型结构聚类法和遗传距离聚类法对甘肃省部分骨干玉米自交系进行聚类分析，结果发现两种聚类方法所得结果与材料系谱信息基本一致;刘海忠等（2018）基于SSR分子标记技术将120份美国和塞尔维亚玉米自交系及2份中国玉米自交系聚类细分为九大主要类群，为欧美优异种质的融入及合理利用提供了参考依据。【本研究切入点】贵州地区抗丝黑穗病玉米种质资源匮乏，且至今鲜见采用SSR分子标记进行抗性种质资源鉴定的研究报道。【拟解决的关键问题】以10份贵州常用玉米自交系材料为研究对象，对其进行丝黑穗抗性鉴定、主要农艺性状评价及SSR遗传多样性分析，旨在为贵州常用玉米的抗丝黑穗病基因挖掘及优质抗性种质资源创建提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试的10份贵州常用玉米自交系材料（表1）均由贵州大学玉米研究所提供，以稳定高感品种渝糯7号为对照。Easy Taq DNA Polymerase for PAGE、High Pure dNTPs和N，N-亚甲双丙烯酰胺等主要试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要设备仪器：T100TM PCR仪（BIO-RAD，美国）、高速冷冻离心机（Eppendorf 5810R，德国）、移液器（Eppendorf，德国）和电泳仪（DYY-10C，北京六一生物科技有限公司）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 丝黑穗病接种及鉴定方法 从前一年典型的玉米丝黑穗病感病植株上采集病瘿，避光阴干后置于布袋内，以备来年鉴定使用。2016—2017年分别在贵州安顺市平坝实验基地（简称平坝基地）及贵阳市花溪区贵州大学鱼塘教学试验场（简称花溪基地）进行接种鉴定。采用育苗盘内菌土育苗完成病菌侵染，育苗前3 d将备用病瘿上的菌粉剥离，过40目铜筛后按0.1%比例与湿润细土充分混合制成菌土，育苗盘规格50穴/盘，每份自交系育苗100穴，每穴3粒种子，用普通细土将育苗盘填充至4/5处，播种后覆盖菌土。待材料长至3～4片叶时，带菌土移栽至试验地，采用随机区组设计，每区2行，3次重复，共30个小区，行长5 m，行距70 cm，株距25 cm，每行11穴，每穴保留2株。

丝黑穗发病情况在玉米进入乳熟末期时进行调查。逐区逐株记载各小区的总株数和发病株数，统计感病率[感病率（%）=发病株数/调查总株数×100]。根据感病率进行抗性分级：感病率在0～1.00%为高抗（HR）;1.10%～5.00%为抗病（R）;5.10%～10.00%为中抗（MR）;10.10%～40.00%为感病（S）;40.10%～100.00%为高感（HS）。

1. 2. 2 田间种植及农艺性状调查方法 2018年将10份玉米自交系种于贵阳市花溪区标准山地。采用随机区组设计，每区2行，3次重复，共30个小区，行长5 m，行距70 cm，株距25 cm，每行11穴，每穴保留2株，所有植株均严格套袋自交。玉米成熟期从每小区随机选取10株植株测量株高、雄穗长、穗位高、茎粗和叶面积;生理成熟期从每小区随机选取已成功套袋自交的10株植株收获测产，并获取穗长、秃尖长、穗粗、穗重、穗行数、行粒数和百粒重等产量相关性状。

1. 2. 3 DNA提取 玉米苗期取幼嫩叶0.2 g于液氮中研磨，参照Saghai-Maroof等（1994）改良的CTAB法提取总DNA，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测其质量后用超纯水稀释，-20 ℃保存备用。

1. 2. 4 SSR分析 选用均匀分布于玉米10个连锁群的136对条带清晰、重复性好的SSR分子标记，标记序列信息来源于玉米基因组数据库（http：//www.maizegdb.org/），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系10.0 μL：10×Buffer（Mg2+） 1.2 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各1.0 μL，dNTPs 0.2 μL，Taq聚合酶（5 U/μL）0.1 μL，DNA模板（40 ng/μL）2.0 μL，ddH2O 4.5 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行35个循环;72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物采用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，参考Wang等（2007）的方法进行银染并观察拍照。

1. 3 統计分析

采用Excel 2010和SPSS 17.0进行统计分析。扩增结果保留主要带型，根据其主要带型区间片段大小对应分子量依次编号为1、2、3、4…n。在相同迁移率位置上，有条带记为“1”，无条带记为“0”，统计[0，1]矩阵。应用POPGENE 32计算等位基因数（Na）、Neis基因多样性指数（H）及多态性信息指数（PIC），PIC=1-∑fi2，其中fi为i位点的基因频率;并按非加权配对算数平均法（UPGMA），采用NTSYS-2.10e进行聚类分析。

2 结果与分析

2. 1 10份贵州常用玉米自交系丝黑穗病抗性鉴定结果

10份贵州常用玉米自交系材料的抗性鉴定结果（表2）表明，高抗自交系有2份（齐319和T32），在连续两年两地的鉴定中其感病率均为0，说明这两个自交系在贵州山区高抗丝黑穗病且十分稳定;感病自交系有6份（HC、苏11、QL16、S37、双M9和郑58），平均感病率为10.39%～36.94%，其中郑58的感病率均在10.00%左右，处于中抗与感病之间;高感自交系2份（J51和J106），平均感病率分别为64.18%和48.62%，其中J51在连续两年两地的鉴定中感病率均明显高于其他材料，为丝黑穗病高感材料。除HC、S37、双M9和郑58外，其他材料在两年两地的抗性鉴定结果基本一致。此外，10份贵州常用玉米自交系材料（除高抗自交系齐319和T32外）2016年在平坝基地的发病情况均高于花溪基地，可能是该试验点具备诱发玉米丝黑穗病所需的温度、湿度等条件，如低温干旱可延长种子幼芽期，进而提高侵染率。

2. 2 10份贵州常用玉米自交系主要农艺性状表现

2. 2. 1 株型性状 如表3所示，10份贵州常用玉米自交系材料的株高为92.20～170.20 cm，变异系数为20.70%;雄穗长为21.70～33.90 cm，变异系数为14.56%;穗位高为19.90～69.67 cm，变异系数为44.13%，说明10份自交系材料在穗位高上变异较大，具有丰富的遗传变异基础;平均茎粗为9.66～14.92 mm，变异系数为14.87%，其中J51和T32均超过14.00 mm，说明这2份自交系材料茎秆粗壮，可能在矿质营养吸收及抗倒伏能力上具有良好表现;叶面积为159.60～412.58 cm2，变异系数为30.64%，其中T32的叶面积最大，表明其具备较强的光接收能力，能为玉米光合作用提供光源基础。

2. 2. 2 穗部性状 10份贵州常用玉米自交系材料中，穗长为8.70～12.65 cm，变异系数为12.48%，J51、双M9、T32和QL16等4份自交系材料的穗长均在11.00 cm以上;穗粗为3.14～7.55 cm，变异系数为36.08%，大部分材料分布在3.00～4.00 cm;穗重为20.50～60.67 g，变异系数为34.45%，以T32和J51较重，分别为60.67和55.00 g;穗行数变化范围在8.00～14.50行，变异系数为17.90%;百粒重变幅为17.00～30.80 g，变异系数为17.30%，以T32和QL16的百粒重较重，约30.00 g，其他材料主要分布在21.00～24.00 g。

综合株型及穗部农艺性状分析发现，10份贵州常用玉米自交系材料在贵州地区均能正常成熟，其中以T32的综合表现较突出，为贵州优势种质材料，J51、J106和双M9次之，齐319的表现相对较差。

2. 3 SSR分子标记分析结果

对PCR扩增条带（图1）进行统计分析，结果如表4所示。以136对SSR引物对10份贵州常用玉米自交系材料进行PCR扩增，共检测到567个等位基因，每对SSR引物检测到2～9个等位基因，平均为4.17个。Neis基因多样性指数（H）变幅为0.180～0.500，平均为0.328;对应的多态性信息量（PIC）变幅为0.150～0.920，平均为0.656。其中多态性最好的SSR分子标记为umc1795。

2. 4 10份贵州常用玉米自交系的聚类分析结果

采用NTSYS-2.10e对10份贵州常用玉米自交系材料进行聚类分析，结果如图2所示。以相似系数0.658为界，10份贵州常用玉米自交系可划分为三大类，类群Ⅰ包括苏11、T32、S37和双M9，均具有热带血缘，属于泰国Suwan种质及墨西哥墨黄9号选系，且在相似系数0.698处，苏11、T32和双M9聚为一个亚类。类群Ⅱ包含先锋选系齐319、美国杂交种选系J106及改良Reid类群下的HC、郑58和QL16，均具有温带血缘，且在相似系数0.671处，同为Reid改良系的HC、郑58和QL16聚为一个亚类，而齐319和J106聚为另一亚类。类群Ⅲ为贵州地方种质J51，其明显区别于其他自交系材料，与具有温带血缘的美国种质较接近。可见，聚类分析结果与种质来源基本吻合，也表明这10份贵州常用玉米自交系材料具有较广泛的遗传基础，可满足玉米育种对亲本遗传差异的基本要求。

3 討论

本研究结果表明，对照品种渝糯7号在连续两年两地的感病率均在90.00%左右，表现为高感，说明抗性鉴定试验的环境及接种处理的各环节均满足玉米丝黑穗病抗性鉴定的需求，鉴定结果可靠。在本研究中，自交系HC和郑58的抗性鉴定为S，平均感病率分别为36.94%和10.39%，与郭满库等（2007）的鉴定结果存在差异，即HC的抗性鉴定为R（感病率4.1%），郑58的抗性鉴定为S（感病率为16.7%）;但对于自交系T32和齐319的抗性鉴定，与郭满库等（2007）、胡安龙和杨再能（2012）的鉴定结果完全一致，感病率均为0，抗性鉴定为HR。造成抗性鉴定结果差异的原因可能是抗性鉴定点环境及接种方法、田间种植管理等因素不同所致，郭满库等（2007）、胡安龙和杨再能（2012）采用田间直接接种法，而本研究是采用育苗盘菌土接种病菌后移栽，但具体原因有待进一步探究。

Suwan种质具有高产稳产、适应性广及特殊抗逆性、抗病虫性等特点（郭向阳等，2015）。本研究中Suwan选系T32高抗玉米丝黑穗病，株型、产量等相关性状表现优良，符合Suwan种质高抗病性及广适应性的特点，但同为Suwan种质的苏11和S37，其农艺性状表现不佳且易感丝黑穗病。究其原因可能是Suwan种质过于庞杂，Suwan选系主要来源于Suwan 1、Suwan 3和Suwan 5等3个群体，且育种者不断对Suwan种质进行改良选育以满足不同的育种目标，最终导致不同Suwan选系间特性不一，差异明显。影响玉米农艺性状的自然因素较多，光照、水分、CO2浓度及土壤肥力等均可对其株型，尤其是穗部产量相关性状造成明显影响。本研究采取随机区组设计，在同等种植条件下对10份贵州常用玉米自交系材料进行农艺性状考量分析，结果发现地方种质J51的农艺性状表现较好，符合地方种质在本土自然环境中较高适应力;先锋选系齐319在农艺性状评测中表现最差，且同属温带血缘材料的HC和郑58表现也较差，可能是温带血缘材料在贵州地区的适应力较低，不及Suwan种质抗逆耐瘠。

本研究中，每对SSR引物平均检测到4.17个等位基因，其平均H为0.328，平均PIC为0.656，与胡萍等（2012）、石海春等（2014）、赵宁娟等（2015）、胡德分等（2016）、刘东军等（2016）、赵文明等（2018）的研究结果相比，所检测到的平均SSR位点及PIC均偏低，但高于祁志云等（2014）、李世风等（2016）、刘海忠等（2018）的研究结果，可能与本研究涉及的玉米自交系较少且SSR分子标记多态性不高有关。基于SSR分子标记可真实可靠地对玉米种质的遗传背景及来源进行类群划分（Yang et al.，2011;Cui et al.，2012;石海春等，2014;刘海忠等，2018）。本研究在SSR分子标记扩增的基础上，采用NTSYS-2.10e对10份贵州常用玉米自交系材料进行UPGMA聚类分析，结果显示可划分为三大类，聚类分析结果与种质来源基本吻合，表明SSR分子标记聚类结果与种质系谱具有较高的一致性。但在本研究中墨黄9号选系双M9与苏11和T32聚为一个亚类，而同为Suwan选系的S37单独聚为一个亚类，其原因可能是：（1）自然界或育种者人为干扰因素导致自交系在选育过程中出现外来基因侵入或自身基因漂移现象;（2）不同育种者对同一自交系进行单株选择时，其标准不一，最终导致名称相同，但自交系自身表现出现偏差;（3）自交系被引入后，经多次改良，使其遗传基础发生明显变化。因此，在聚类分析中会出现聚类分析结果与供试材料系谱不完全对应的现象。

4 结论

贵州常用玉米自交系材料具有较广泛的遗传基础，可满足玉米育种对亲本遗传差异的基本要求。尤其是自交系T32高抗玉米丝黑穗病且在贵州山区具有良好的适应性，为热带血缘Suwan选系，明显区别于改良Reid选系、先锋选系、美国杂交种选系及贵州地方种质等，可优先用于贵州地区抗丝黑穗病基因发掘、杂交种改良及优良抗性种质资源创建。

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（責任编辑 兰宗宝）