甘蔗幼苗对难溶性磷的吸收及其根系对低磷胁迫的响应

柯野　谢璐　蓝林　潘俊臣　唐新莲

摘要：  為明确甘蔗适应低磷胁迫的生理生化机制，挖掘甘蔗对磷素的利用潜力，揭示甘蔗对低磷胁迫适应的可能机制，该研究以ROC22和ROC10两个甘蔗品种为材料，采用水培和土培的方法研究了甘蔗幼苗对难溶性磷的吸收及其在低磷胁迫下根构型和根系的生理反应。结果表明：（1）培养在以难溶性磷（Ca-P和Al-P）为磷源的培养液中的甘蔗的叶片数、地上部干重、生物量较缺磷（-P）处理显著增加，与对照（+P）的相当，甘蔗总磷积累量也显著提高，达到对照（+P）处理磷积累量的30%～77%。（2）在低磷条件下，甘蔗幼苗的根系有向土壤深层分布的趋势，根的总体积增大、最长根长变长、浅根系分布增多。（3）甘蔗幼苗在低磷环境下，根际环境明显酸化，且根系分泌物能溶解难溶性的铝磷，植株体内酸性磷酸酶的活性也明显增强。以上表明甘蔗幼苗有较强的吸收利用难溶性磷的能力，而低磷条件下根系数量增加、主根的向地性、浅根系分布增多、根际酸化以及植株体内酸性磷酸酶活性的增强可能是甘蔗幼苗适应缺磷环境的重要机制。

关键词： 甘蔗， 低磷胁迫， 难溶性磷， 根构型， 适应机制

中图分类号：  Q945.78文献标识码：  A文章编号：  1000-3142（2019）12-1673-08

Abstract：  In order to make clear the physiological and biochemical mechanism of sugarcane adapting to low phosphorus stress， to tap the potential of sugarcane self-phosphorus， and to reveal the possible mechanisms of sugarcane adaptation to low phosphorus stress， the absorption of insoluble phosphorus in sugarcane seedlings， the physiological responses to root and root architecture under low phosphorus stress by hydroponic and pot-culture were studied， by using two sugarcane varieties ROC22 and ROC10 as materials. The results were as follows： （1） The number of leaves， the dry weight of the shoots and the biomass of sugarcane in the culture medium with insoluble phosphorus （Ca-P and Al-P） as phospho-rus source， were significantly increased compared with those treated with phosphorus deficiency （-P）. Moreover， compared with the control （+P）， the total phosphorus accumulation of sugarcane also increased significantly， reaching 30%-77% of the phosphorus accumulation in the control （+P） treatment. （2） Under the condition of low phosphorus， the roots of sugarcane seedlings tended to distribute in deep soil， the total volume of roots increased， the longest root length became longer， and the distribution of shallow roots increased. （3） Under the low phosphorus environment， the sugarcane seedlings were obviously acidified in the rhizosphere environment， and the root exudates could dissolve the inso-luble aluminum phosphorus， and the activity of acid phosphatase in the plants was also significantly enhanced. The above results indicate that sugarcane seedlings have strong ability to absorb and use insoluble phosphorus， while roots increase under low phosphorus conditions， the roots of the main roots and the distribution of shallow roots increase， the acidification of the rhizosphere and the enhancement of acid phosphatase activity in the plants， which may be an important me-chanism for sugarcane seedlings to adapt to the phosphorus deficiency environment.

Key words： sugar cane， low phosphorus stress， insoluble phosphorus （P）， root-system configuration， adaptive mechanism

磷素不仅是核酸、蛋白质、磷脂等有机化合物的重要组成成分，而且参与植物体内光合与呼吸、酶的活化、信号转导等多种生理过程，对植物的生长发育、产量和品质具有显著影响（Olday，1972;刘辉，2003）。由于南方酸性土壤对磷的强烈化学固定作用，致使土壤磷素多以 Fe-P、Al-P 和O-P等难溶态存在，即土壤全磷含量高（于姣妲等，2017），但磷肥当季利用率一般为5%～20%（闫金垚等，2018），土壤缺磷成了作物生产的主要限制因素之一。植物为适应土壤中磷素的匮乏，其根系往往表现出强烈的形态和生理上的反应。孙淼等（2018）和韦如萍等（2018）研究发现，作物在低磷胁迫下会发生形态学上的变化，最明显的是根冠比增加、根长增长、根系覆盖面积扩大，以此增加磷吸收来适应低磷环境。同时，作物根系分泌物对提高土壤磷素的生物有效性具有非常重要的意义（Zou et al.，2018），它可以通过活化溶解难溶性的无机磷以及参与分解有机磷以提高根际有效磷的浓度，供作物吸收利用（梁翠月等，2015）。苜蓿（杨利宁等，2015）、玉米（陶佩琳等，2013;陈曙等，2018）和水稻（Hu et al.，2016）的根系分泌物都具有提高土壤磷素有效性，促进植物吸收利用难溶性磷酸盐的作用。目前，有关低磷胁迫对甘蔗根系构型的影响、甘蔗对难溶性磷的活化利用的研究尚未见报道。因此，本研究从甘蔗根系形态特征、根系分泌物以及酸性磷酸酶等入手，研究甘蔗对低磷胁迫的适用，对进一步探讨甘蔗耐低磷胁迫的分子机制及培育耐低磷甘蔗品种等均有重要指导意义，对于节约资源、保护环境和降低甘蔗生产成本也具有一定的作用。

1材料与方法

1.1 供试材料

供试甘蔗品种为新台糖22号（ROC22）和新台糖10号（ROC10），由广西大学农学院提供。

1.2 试验处理

1.2.1 水培均选取甘蔗中上部，砍5 cm左右单芽茎，将砍下的甘蔗种茎放置在饱和石灰水中浸泡、催芽、灭菌，12 h后取出，先在育苗基质中育苗至3片展开叶，再转移至水培塑料小桶中。幼苗移栽时去掉一半种根，以减少种茎根系对试验的影响。处理时先用0.1 mmol·L-1的氯化钙培养1周，以利于甘蔗适应水培环境并生根。再用1/5霍格兰营养液培养4 d（pH=6.0），作为供试材料。

试验共设计4个处理：1/5霍格兰培养液（+P，CK，0.25 mmol·L-1 NH4H2PO4）、无磷培养液（-P）、添加0.25 mmol·L-1磷酸铝的无磷培养液（-P+Al-P）、添加0.25 mmol·L-1磷酸钙的无磷培养液（-P+Ca-P）。将甘蔗幼苗分别培养于上述培养液中，电磁式空气泵每小时通气15 min，每隔2 d换一次培养液。培养38 d后收獲。收获前收集根系分泌物，进行分泌物对难溶性磷的络合溶解及原位显色检验。收获时测定株高、叶长、叶宽、叶片数等表型性状。采集正一叶测定酸性磷酸酶，其余地上部和地下部剪碎烘干后测定生物量及磷含量。

1.2.2 盆栽设置土壤不施磷肥（-P/-P）、上层施磷肥（+P/-P）、下层施磷肥（-P/+P）和上下层均施磷肥（+P/+P）处理。上层和下层土厚均为15 cm，中间用无纺布隔开，无纺布中间插入2根PVC水管。施磷处理的P2O5用量为0.3 g·kg-1，不施时为0 g·kg-1。氮肥（N）均为0.4 g·kg-1，钾肥（K2O）均为0.44 g·kg-1。每个处理3个重复，每盆定植2株，80 d之后收苗，收苗时将植株根系清洗干净，采用根系扫描-WinRHIZO图像分析系统，获取根系的最长根长、总体积等二维根构型参数。之后从无纺布处将根系剪断，分上下层收获。剪碎烘干后测定植株根的干重。供试土壤为第四纪红土母质发育的砂质土：全磷0.13 g·kg-1，速效磷0.79 mg·kg-1，pH 4.62。

1.3 指标测定方法

根尖原位显色参照苏宝玲等（2000）的方法。将6 mg的溴甲酚紫和0.5 g琼脂加入100 mL 1 mmol·L-1的CaSO4溶液中，在电炉上不断搅拌加热至沸腾。在常温下搅拌冷却，用0.01 mol·L-1的HCl调节pH至溶液呈暗红色。选取粗细一致的+P、-P处理的根系平铺于培养皿中，每个平板中放2条根，倒入混合液，冷却凝固制作成厚度均一的平板，2 h后观察根际颜色变化并拍照。

根系分泌物收集方法：水培收获前一天将-P、+P处理用去离子水洗涤数次，用0.5 mmol·L-1的CaCl2培养过夜。次日早上换上同样浓度的CaCl2继续培养24 h后，于冷库中收集根系分泌物，收集时将培养液依次经过H+型阳离子树脂和甲酸型阴离子树脂。收集完毕后取下阴离子树脂，用超纯水配制的0.2 mol·L-1HCl分3次（每次用量为3 mL）洗脱吸附在阴离子树脂中的根系分泌物于150 mL的浓缩瓶中，用旋转蒸发仪减压蒸发至干燥。浓缩条件为真空、40 ℃水浴。残留物用1.5 mL超纯水分三次震荡溶解并用水系微孔膜过滤至2 mL的离心管中，存于-20 ℃冰箱中备用。

分析根系分泌物络合铝时所用混合液：25 mL 5 mmol·L-1的AlCl3、4 mL 2 mol·L-1的HCl、67 mL超纯水、120 mL丙酮。将层析滤纸侵入混合液中15 min，然后浸没于pH 6.8的磷酸缓冲液中，15 min后取出，用蒸馏水洗涤后干燥备用。在干燥滤纸上分4次加点分泌物，每次5 μL，之后晾干浸于pyrocatechol violet溶液中染色5～10 min。滤纸经去离子水洗涤多次，除去多余染料，晾干拍照。

酸性磷酸酶的测定采用McLachlan et al.（1987）的方法并略做改动。称取剪碎的正一叶0.2 g，加入少许石英砂和液氮研磨匀浆，加入5 mL 0.2 mol·L-1 pH 5.6的醋酸-醋酸钠，转移至10 mL离心管中，10 000 r·min-1离心10 min，得上清液备用。反应液为0.5 mL酶液，0.45 mL醋酸缓冲液，4.5 mL 5 mmol·L-1的对硝基酚磷酸二钠。混匀后30 ℃黑暗反应30 min，加入2 mL 2 mol·L-1的NaOH终止反应，405 nm下测定OD值。以1 mmol·L-1对硝基酚为溶质，2 mol·L-1的NaOH为溶剂配制标准曲线。酶活性单位以单位时间单位鲜重水解对硝基酚磷酸二钠生成对硝基酚的量表示，即Μ=μmol NP·mg Pro-1·min-1。

1.4 数据处理

利用Excel软件处理数据并作图，数据均采用 Excel 2007软件处理，用 SPSS 17.0 软件进行显著性检验和多重比较（新复极差法）。

2结果与分析

2.1 难溶性磷对甘蔗幼苗生长的影响

表1结果显示，经缺磷（-P）处理后两个甘蔗品种的株高、叶长、叶宽和叶片数均较对照（+P）降低，除了ROC22品种的叶长和ROC10品种的株高和叶长没达到显著水平外，其余的均达到显著水平，可见缺磷使甘蔗幼苗生长明显受阻;但添加了难溶性磷后，甘蔗的株高、叶长、叶宽和叶片数较缺磷（-P）处理均增加，其中ROC22品种的叶宽和叶片数达显著水平;品种ROC22的Ca-P处理下的株高、叶长和叶片数与CK（+P）处理的相当，无显著差异。这些结果表明难溶性磷对甘蔗幼苗缺磷状况有所缓解。

表2结果显示，缺磷（-P）处理后的两个甘蔗品种的地上部干重、生物量均较对照（+P）显著降低，根冠比显著增加（P<0.05），其中品种ROC22的地上部以及生物量分别降低了47%和38%，根冠比提高了1.3倍，品种ROC10的地上部以及生物量分别降低了37%和30%，根冠比提高0.9倍;在添加了难溶性磷（Ca-P和Al-P）后，甘蔗的地上部干重、生物量较缺磷（-P）处理显著增加，根冠比显著降低，与对照（+P）的相当，无显著差异。

上述结果说明甘蔗幼苗能吸收利用难溶性磷以促进生长，且ROC22品种吸收利用难溶性磷的能力较ROC10品种强。

2.2 甘蔗对难溶性磷的吸收和利用

图1结果表明，各处理总磷积累量间均差异显著（P<0.05），ROC22的Ca-P、Al-P和-P处理分别较CK（+P）处理减少了32%、70%和92%，ROC10的各处理分别较CK（+P）处理减少了23%、63%和91%，这表明甘蔗幼苗对难溶性磷和可溶性磷的利用上存在差异。ROC22和ROC10的Ca-P、Al-P处理的总磷积累量较-P处理显著提高，分别是-P处理的8.5、3.8倍和8.9、4.2倍。这表明甘蔗具有较强的利用难溶性磷酸盐的能力。

在磷的利用效率上（图2），Ca-P处理和对照处理相当，而Al-P处理较Ca-P处理和对照处理有显著提高（P<0.05），品种ROC22分别提高了1.7、1.2倍，品种ROC10分别提高了1.4、1.0倍，与Ca-P相比，甘蔗能更好地利用Al-P。

2.3 甘蔗对低磷胁迫适应的可能机制

2.3.1不同处理对甘蔗根系的影响表3结果表明，低磷胁迫对甘蔗根系的分布以及生长有显著影响。不施磷处理（-P/-P）较其他处理相比，甘蔗幼苗根系的总体积和最长根长均明显提高，其中（+P/-P）及（-P/-P）處理的根系总体积达显著水平;ROC22和ROC10两品种仅上层施磷（+P/-P）处理的根系总体积和最长根长也仅较下层施磷处理（-P/+P）的明显增加，根系总体积分别增加了28.9%和8.4%，最长根长分别增加了4.5%和21.0%;且上层施磷（+P/-P）处理的ROC22和ROC10的上下层根干重较仅下层施磷（-P/+P）处理的显著提高。上述结果表明，低磷条件下甘蔗根系总体积增加、主根加深、以浅根系分布为主，呈浅层根系吸磷的构型。

2.3.2 缺磷诱导根际酸化及根系分泌物对难溶性磷的溶解图3结果表明，+P处理的甘蔗根系周围的溴甲酚紫的琼脂平板颜色无明显变化，而-P处理的甘蔗根尖周围呈现明显黄色，表明低磷胁迫下甘蔗根尖有酸性物质分泌，使根尖明显酸化。

邻苯二酚紫染色-试纸法结果（图4）表明，甘蔗幼苗经-P处理后所收集的根系分泌物能溶解滤纸上的AlPO4而呈亮斑，+P处理的根系分泌物不能溶解AlPO4。可见，低磷胁迫下，甘蔗根系分泌物能溶解难溶性的铝磷，从而促进磷的吸收。

2.3.3 低磷胁迫对甘蔗酸性磷酸酶的影响从图5可以看出，在-P处理下，ROC22和ROC10的叶片中酸性磷酸酶的活性分别达到了29.54 μmol NP·mg Pro-1·min-1和36.01 μmol NP·mg Pro-1·min-1，与+P处理相比，显著提高了4.3和2.5倍。这表明甘蔗幼苗在缺磷的情况下，体内酸性磷酸酶的活性会显著增加。

3讨论

3.1 甘蔗幼苗对难溶性磷的吸收利用

在南方酸性红壤中，磷极易与铝、铁等结合形成难溶性磷，一般而言，植物无法直接吸收利用这部分磷源，因此难溶性磷的活化溶解是植物吸收磷和提高磷利用率的前提。本研究发现，不同甘蔗品种的难溶态磷利用效率存在差异，前人在桉树和水稻的研究也有相似结论（李锋等，2003）。在对比不同磷处理间甘蔗的生理特征时发现，以难溶性磷（Ca-P和Al-P）作为磷源的两个甘蔗品种的叶片数、地上部干重、生物量较缺磷（-P） 处理显著增加，与对照（+P）的相当（表1、表2），且甘蔗总磷积累量也较缺磷（-P）处理显著提高， 达到对照（+P）处理磷积累量的30%～77%（图1），这些结果说明甘蔗幼苗有较强的活化和利用难溶性磷酸盐的能力。

3.2 甘蔗幼苗对低磷胁迫环境的适应及可能机制

根系是联系作物与土壤的纽带，是作物吸收养分、水分的重要器官。根系在对环境养分变化的感知过程中，面对养分胁迫可产生形态和生理上的可塑性变化来增强作物的自主适应性（罗佳等，2016）。已有研究表明，在低磷胁迫下，一些植物的根系变浅、侧根长度和密度增加、总根长增加、主根加深，形成浅层根系吸磷、深扎主根吸水吸肥的“伞状”或“须状”根系构型提高植株对土壤磷的吸收利用（George et al.，2011;Rouached et al.，2010;刘灵，2008）。甘蔗在面对低磷胁迫时，甘蔗也会通过改变其根构型与各种根系性状等来适应逆境环境，如总根长增加或保持一定的稳定，其主要原因是由于根茎粗下降、根变细，这是植物对环境的适应性的一种表现，即通过增加根系的长度来缩短养分离子扩散到植物根的距离和扩大根系的吸收面积（郑超等，2015;曾巧英等，2015）。本研究也发现，低磷条件下的甘蔗幼苗根构型也做出相应的改变，其根系的总体积与最长根长明显增长，上层土壤供磷后处理的甘蔗上下土层中的根干重比也显著增加，表明甘蔗在面对低磷胁迫时，根系总体积增加，表层土壤根系数量增多，主根有向深层土壤分布的趋势。甘蔗这种根系特性的变化，既有利于在低磷环境下吸收更多的磷，也有利于幼根对深层磷的吸收利用。可见，调节根系对不同土层磷的吸收利用可能是甘蔗适应酸性低磷土壤环境的重要机制。

难溶性磷的活化利用包括植物根系合成和分泌有机酸对无机磷的活化以及植物分泌酸性磷酸酶参与有机磷的活化（梁翠月等，2015）。本研究结果发现，低磷胁迫会使甘蔗幼苗根系分泌酸性物质，酸化根际，而且根系分泌物的酸性物质会溶解难溶性的铝磷，从而变成可溶性磷被甘蔗吸收利用，说明根际酸化是植物适应磷胁迫环境的重要机制。这与兰忠明等（2012）对紫云英和陶佩琳等（2013）对玉米的研究结果相一致。酸性磷酸酶在植物面对低磷胁迫时起到重要作用（Cai et al.，2018）。本研究发现，甘蔗幼苗在低磷胁迫时，植株体内的酸性磷酸酶活性明显增加，这主要是因为酸性磷酸酶能够水解有机磷，释放出能够被植物吸收利用的无机磷。

综上所述，甘蔗幼苗吸收利用难溶性磷酸盐的能力较强，在低磷条件下，甘蔗根系总体积增加、主根加深、浅根系分布增多，分泌酸性物质酸化根际土壤环境以活化利用难溶性磷，提高酸性磷酸酶的活性可能是甘蔗对低磷胁迫的适应性机制。

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