近红外光谱法快速测定怀地黄中总苯乙醇苷、总环烯醚萜苷的含量

耿晓桐 王丰青 苏秀红 陶晓赛 李雅静 雷敬卫 谢彩侠

中圖分类号 R927 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）02-0225-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.02.17

摘 要 目的：建立快速测定怀地黄中总苯乙醇苷及总环烯醚萜苷含量的方法。方法：采用紫外-可见分光光度法测定药材样品中总苯乙醇苷及总环烯醚萜苷的含量。采用近红外光谱法结合偏最小二乘法，最佳光谱预处理方法分别为多元散射校正法联合一阶导数法、标准归一化法联合一阶导数法，最佳光谱范围分别为6 703.35～11 065.54 cm-1、 3 999.63～9 102.36 cm-1，最佳主因子数分别为10、7，建立药材样品中总苯乙醇苷及总环烯醚萜苷含量的定量分析模型。结果：药材样品中总苯乙醇苷及总环烯醚萜苷含量测定方法学经验证符合要求。总苯乙醇苷、总环烯醚萜苷定量模型的校正集内部交叉验证相关系数分别为0.998 2、0.980 9，校正均方根偏差分别为0.032 7、0.186 0，预测均方根偏差分别为0.035 5、0.035 1，交叉验证均方根偏差分别为0.256 9、0.574 3。总苯乙醇苷、总环烯醚萜苷含量的预测值分别为0.268%～1.636%、3.424%～6.978%，测定值分别为0.299%～1.629%、3.431%～6.952%，绝对偏差分别为-0.042%～0.067%、-0.111%～0.088%，相对偏差分别为-0.819%～0.076%、-2.257%～1.672%，预测值与测定值比较差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：该方法快速准确、简便，可用于不同种质怀地黄中总苯乙醇苷及总环烯醚萜苷含量的测定。

关键词 怀地黄；近红外光谱法；偏最小二乘法；总苯乙醇苷；总环烯醚萜苷；快速测定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for rapid determination of total phenylethanoid glycosides and total iridoid glycosides in the root of Rehmannia glutinosa. METHODS： The contents of total phenylethanoid glycosides and total iridoid glycosides in medicinal material samples were determined by UV spectrophotometry. Quantitative model of total phenylethanoid glycosides and total iridoid glycosides in medicinal samples was established by NIRS-PLS method. The optimal pretreatment spectra were multivariate scattering correction combined with first derivative method， standard normalization combined with first derivative method. The optimum spectral ranged from 6 703.35-11 065.54 cm-1 and 3 999.63-9 102.36 cm-1. The optimum principal factor number were 10 and 7. RESULTS： The content determination of total phenylethanoid glycosides and total iridoid glycosides in medicinal material samples was proved to meet the requirements by methodological experience. The internal cross validation determination coefficients of total phenylethanoid glycosides and total iridoid glycosides were 0.998 2 and 0.980 9. The correction of root mean square error was 0.032 7 and 0.186 0. The root mean square error of prediction were 0.035 5 and 0.035 1. The root mean square error of cross validation were 0.256 9 and 0.574 3. The predicted values of total phenylethanol glycosides and total iridoid glycosides were 0.268%-1.636% and 3.424%-6.978%， respectively； the determination value of them were 0.299%-1.629% and 3.431%-6.952%， respectively； the absolute deviations were -0.042%-0.067% and -0.111%-0.088%， respectively；the relative deviations were -0.819%-0.076%、-2.257%-1.672%， respectively；There was no statistical significance between predicted values and measured values （P>0.05）. CONCLUSIONS： The method is accurate and simple. The method can be used for the rapid determination of total phenylethanoid glycosides and total iridoid glycosides in different germplasms of R. glutinosa.

KEYWORDS Rehmannia glutinosa； NIRS； PLS； Total phenylethanoid glycosides； Total iridoid glycosides； Rapid determination

地黄（Rehmannia glutinosa Libosch.）是玄参科（Scrophulariacease）地黄属（Rehmannia）多年生草本植物，始载于《神农本草经》，在我国河南、山东等地均有大量种植。由“今人惟以怀庆地黄为上，亦各处随时兴废不同尔”等本草考证可知，河南作为地黄道地产区的地位没有动摇，故河南产地黄亦称为怀地黄，其具有生精补髓、滋阴补肾、清热生津、防癌、抑制皮肤真菌、抗炎、抗增生、降糖和增强免疫力等功效[1-3]，是我国“四大怀药”之一，也是临床应用较多的大宗中药材。地黄中含有多糖[4]、苯乙醇苷类[5]、环烯醚萜苷类[6]、梓醇[7]、核苷[8]等成分。其中，苯乙醇苷类成分具有抗病毒、抗肿瘤、强心、抗菌、免疫调节、保肝、抗氧化、增强记忆等作用[9]；环烯醚萜苷类成分具有神经保护、利尿、抗炎、缓泻、降糖、抗癌、补血等作用[10]。苯乙醇苷类及环烯醚萜苷类成分是地黄主要的活性成分。有研究发现，不同种质不同生育期内怀地黄块根中总苯乙醇苷类及总环烯醚萜苷类成分含量差异较大[11]。因此这两种成分可作为评价怀地黄质量的指标，其含量快速测定方法的建立对于怀地黄质量的评价及资源的利用具有重要意义。

不同种质怀地黄中总苯乙醇苷类及总环烯醚萜苷类成分含量不同，常用测定方法为紫外-可见分光光度法（UV），但该方法的样品前处理较为复杂，引入的误差来源较多，试剂用量较大，环境污染较为严重，不符合中药现代化的要求[5-6]。近红外光谱法（NIR）作为一种无损的分析方法，具有分析速度快、操作简便、消耗低、绿色环保等优点，其所反映的信息符合中药整体性的特征，已广泛用于中药的质量控制[12-13]。目前，尚未有NIR法测定地黄块根中总苯乙醇苷类及总环烯醚萜苷类成分的研究。为此，本研究以不同种质怀地黄为研究对象，建立了快速测定怀地黄块根中总苯乙醇苷及总环烯醚萜苷含量的NIR法，旨在为怀地黄种质资源优选及质量评价提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Nicolet 6700型傅立叶变换NIR仪，包括光源、分光系统、测量附件、检测器（赛默飞世尔科技有限公司）；WFZ UV-2000型UV计（优尼柯仪器有限公司）；FW-100型高速万能粉碎机（北京科伟永兴仪器有限公司）；101-3AB型电热恒温鼓风干燥箱（北京中兴伟业仪器有限公司）；KQ-700DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ME204E/OL型万分之一电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；HH-S2型双孔智能水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）；YE5K613352型移液枪（上海荣泰生化工程有限公司）。

1.2 药品与试剂

毛蕊花糖苷对照品（四川省维克奇生物科技有限公司，批号：MUST-17020715，纯度：99.57%）；梓醇对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-17102510，纯度：99.46%）；甲醇（分析纯）、无水乙醇（分析纯）均由天津市致远化学试剂有限公司提供；2，4-二硝基苯肼（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）；盐酸（分析纯，烟台市双双化工有限公司）；氢氧化钠（分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司）；水为蒸馏水。

1.3 药材

6种种质怀地黄块根均采集于河南省温县武德镇亢村怀地黄种植基地，经河南中医药大学药学院董诚明教授鉴定为玄参科（Scrophulariacease）地黄属（Rehmannia）植物。整个生育期内共收集怀地黄块根128份（批号：S1～S128，S1～S24为85-5地黄生育期内样品，S25～S48为BJ-1地黄生育期内样品，S49～S72为白变地黄生育期样品，S73～S96为金九地黄生育期内样品，S97～S112为山东地黄生育期内样品，S113～S128为QH-1地黄生育期内的样品；85-5指温县农科所王乾琚以单县151为母本，金状元为父本，杂交选育的高产优质地黄新品种，BJ-1指用农家地黄品种新状元和武陟一号杂交培育的新品种，QH-1指地黄品种沁怀在河南引种后的一个新品种）。将怀地黄块根洗净，于真空干燥箱55 ℃烘干，粉碎后过50目筛，保存于干燥器中，备用。

2 方法与结果

2.1 UV法测定总苯乙醇苷的含量

2.1.1 供试品溶液的制备 精密称取药材样品粉末约1 g，置于具塞锥形瓶中，加60%甲醇50 mL，称定质量，超声（功率：220 W；頻率：100 Hz）处理30 min，放至室温，再次称定质量，用60%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液1 mL，置于10 mL量瓶中，加60%甲醇定容至刻度，即得[5]。

2.1.2 对照品溶液的制备 取毛蕊花糖苷对照品1.21 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得。

2.1.3 线性关系考察 精密量取“2.1.2”项下对照品溶液0.5、0.6、0.7、1.0、1.2、1.8 mL，分别置于5 mL量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，得质量浓度分别为0.012 1、0.014 5、0.016 9、0.024 2、0.029 0、0.043 5 mg/mL的线性关系工作溶液。以60%甲醇为空白，于332 nm波长[14]处测定吸光度。以待测物质量浓度（x，mg/mL）为横坐标、吸光度（y）为纵坐标进行线性回归，得毛蕊花糖苷回归方程为y=25.94x+0.078 1（r=0.992 5）。结果表明，毛蕊花糖苷检测质量浓度线性范围为0.012 1～0.043 5 mg/mL。

2.1.4 方法学考察 按2015年版《中国药典》（四部）[14]标准进行方法学考察。结果表明，精密度、稳定性、重复性试验吸光度的RSD均小于3.00%，表明仪器精密度、供试品溶液稳定性、方法重复性均较好。总苯乙醇苷加样回收率范围为99.83%～102.11%，RSD为2.12%（n=6）。

2.1.5 样品含量测定 取“2.1.1”项下供试品溶液2 mL，置于比色皿中，于332 nm波长[15]处测定吸光度，平行测定3次，计算样品含量，结果见表1。

2.2 UV法测定总环烯醚萜苷的含量

2.2.1 供试品溶液的制备 精密称取药材样品粉末约1 g，置于具塞锥形瓶中，加70%乙醇10 mL，称定质量，超声（功率：220 W；频率：100 Hz）处理45 min，放至室温，再次称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，滤过，取续滤液，用70%乙醇定容至50 mL量瓶中，摇匀，取2.5 mL，置于50 mL量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，摇匀，即得[6]。

2.2.2 对照品溶液的制备 取梓醇对照品5.21 mg，置于25 mL量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，即得。

2.2.3 线性关系考察 精密量取“2.2.2”项下对照品溶液1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，加70%乙醇稀释并定容至刻度，摇匀，得质量浓度分别为0.031 3、0.041 7、0.052 1、0.062 5、0.083 4 mg/mL的线性关系工作溶液。另取“2.2.3”项下空白对照，于462 nm波长[6]处测定吸光度。以待测物质量浓度（x，mg/mL）为横坐标、吸光度（y）为纵坐标进行线性回归，得梓醇回归方程为y=10.609x-0.091 8（r=0.995 5）。结果表明，梓醇质量浓度线性范围为0.031 3～0.083 4 mg/mL。

2.2.4 方法学考察 按2015年版《中国药典》（四部）[14]标准进行方法学考察。结果表明，精密度、稳定性、重复性试验吸光度的RSD均小于3.00%，表明仪器精密度、供试品溶液稳定性、方法重复性均较好。总环烯醚萜苷加样回收率范围为100.21%～102.76%，RSD为2.21%（n=6）。

2.2.5 样品含量测定 取“2.2.1”项下供试品溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，加1 mol/L盐酸2 mL，摇匀，于90 ℃水浴中反应15 min，放至室温，加二硝基苯肼乙醇溶液0.5 mL，摇匀，于90 ℃水浴中反应25 min，室温静置15 min，放冷，加1 mol/L的氢氧化钠70%乙醇溶液（将氢氧化钠用70%乙醇配制为1 mol/L的溶液）3 mL，摇匀，室温静置1 h。取70%乙醇1 mL，按上述从“置于10 mL量瓶中起至室温静置1 h”操作得空白对照，于462 nm波长[6]处测定吸光度，平行测定3次，计算样品含量，结果见表2。

2.3 NIR定量模型的建立与验证

2.3.1 NIR光谱的采集 分别取128批药材样品粉末适量，平铺于样品杯内，置于NIR仪中，采用积分球漫反射法采样。采集条件：分辨率为8 cm-1，扫描范围为12 000～ 4 000 cm-1，扫描次数为64次，每批药材样品采集3张光谱。128批药材样品近红外光谱原始叠加图见图1。

2.3.2 校正集和验证集样品的选择 根据表1、表2药材样品中总苯乙醇苷、总环烯醚萜苷含量测定结果，按照校正集与验证集样品比例4 ∶ 1、验证集样品的含量范围在校正集样品含量范围内的原则，分别选择99批、26批药材样品作为总苯乙醇苷的校正集和验证集（S2、S7、S22药材样品因偏差较大忽略不计）；分别选择100批、27批药材樣品作为总环烯醚萜苷的校正集和验证集（S99药材样品因偏差较大忽略不计），结果见表3、表4。

2.3.3 光谱预处理方法的选择 不同种质不同生育期内的药材样品由于物理性质及测定条件等差异，会引起光谱基线漂移和斜率的变化，进而影响模型的预测性能，因此在建模前需要消除基线漂移和斜率的影响，采用NIR仪配套软件对原始光谱进行预处理。常用的预处理方法有原始光谱（Constant）、一阶导数法（FD）、多元散射校正法（MSC）、二阶导数法（SD）、标准归一化法（SNV）、平滑滤波系数法（SG）、直接差分法（ND）。

以校正集内部交叉验证相关系数（R2）、校正均方根偏差（RMSEC）、预测均方根偏差（RMSEP）为指标，评价模型的准确性与适用性，详见表5、表6。R2越接近1，表示预测值与测定值越接近；RMSEC、RMSEP越小，表示模型预测效果越好，适用性越好。预处理后的近红外光谱见图2、图3。

由表5、表6、图2、图3可知，总苯乙醇苷、总环烯醚萜苷的最佳光谱预处理方法分别为MSC+FD、SNV+FD，表明所建总苯乙醇苷、总环烯醚萜苷模型的预测性能均较好。

2.3.4 建模光谱范围的选择 近红外光谱主要反映基团伸缩振动产生的倍频峰、组频峰的信息，由于倍频峰及组频峰的强度较弱不易区分，各峰重叠严重，因此冗余信息及噪音干扰较大。为获取与待测组分含量相关的最大信息，以建立最优的预测模型，对不同光谱范围所建模型性能进行考察，详见表7、表8。

由表7、表8可知，总苯乙醇苷、总环烯醚萜苷含量预测的最佳建模光谱范围分别为6 703.35～11 065.54 cm-1、3 999.63～9 102.36 cm-1。

2.3.5 主因子数的选择 在校正集药材样品相同的条件下，主因子数的选择对模型的准确性和NIR预测结果有较大影响，主因子数过少或过多均可影响模型的准确性。以交叉验证均方根偏差（RMSECV）为评价指标，RMSECV最小时得到的因子数为最佳主因子数，详见图4。

由图4可知，总苯乙醇苷、总环烯醚萜苷定量模型的RMSECV最小值分别为0.256 9、0.574 3，得到的最佳主因子数分别为10、7。

2.3.6 定量模型的建立 分别将99批总苯乙醇苷校正集样品和100批总环烯醚萜苷校正样品，通过TQ 8.0分析软件结合偏最小二乘法（PLS）法，分别采用最佳光谱预处理方法MSC+FD、SNV+FD，最佳建模光谱范围6 703.35～11 065.54 cm-1、3 999.63～9 102.36 cm-1，最佳主因子数10.7，建立定量分析模型。总苯乙醇苷、总环烯醚萜苷校正集样品NIR模型见图5、图6。

由图5、图6可知，预测值与测定值相关性较好，所建模型准确性、适用性好。

2.3.7 定量模型的验证 分别在总苯乙醇苷、总环烯醚萜苷的定量分析模型中，将26批总苯乙醇苷验证集样品和27批总环烯醚萜苷验证集样品含量的测定值与预测值进行比较并计算偏差，详见表9、表10[注：绝对偏差=（预测值-测定值）；相对偏差=（预测值-测定值）/测定值]。

由表9、表10可知，NIR所建模型预测总苯乙醇苷、总环烯醚萜苷的含量结果与UV法的测定结果接近，绝对偏差及相对偏差均较小；经SPSS 19.0统计软件配对t检验，预测值与测定值比较差异均无统计学意义（P>0.05）。这表明所建模型的预测性能均较好，可用于药材样品中总苯乙醇苷、总环烯醚萜苷的含量测定。

3 讨论

由于怀地黄种质资源较丰富，不同种质怀地黄的表型性状（指不同种质怀地黄形状、大小）及质量差异较大，为保证所建模型的使用范围，本研究以怀地黄产区6种种质怀地黄为研究对象，共收集到不同生育期内的怀地黄块根样品128批，样品信息基本涵盖了怀地黄种质和生育期的差异对待测成分的影响，具有一定的代表性。

NIR不仅可反映药材样品内部的组分、电负性和氢键等化学信息，还可反映样品的色泽、黏度、密度、颗粒度、均匀度等物理信息，可从整体上对药材样品的性状及质量进行综合评价。为提高模型的预测性能，本研究选择具有代表性的校正集样品，以最佳光谱预处理方法、建模光谱范围和主因子数建立校正模型，并对所建模型的预测性能进行评价，以保证模型的准确性。

NIR是一种间接的分析方法，该方法的准确性和适用性取决于药材样品的数量、代表性、参考值测定的准确性及采集条件的稳定性等，而药材样品数量及代表性是建立较好性能模型的前提。本研究建立了怀地黄块根中总苯乙醇苷及总环烯醚萜苷的定量分析模型，但模型并未涵盖地黄产地差异的信息，因此后续还有待采集其他产地的地黄，扩大样本量以进一步完善和优化模型。

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（收稿日期：2018-08-01 修回日期：2018-11-14）

（编辑：陈 宏）