苯扎贝特和非诺贝特对肺腺癌PC-9细胞增殖和c-myc表达的影响

王桂平 梁杰聪 李智斌 张彦焘

中圖分类号 R361+.3;R734 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）21-2931-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.21.11

摘 要 目的：研究贝特类药物苯扎贝特和非诺贝特对肺腺癌PC-9细胞增殖和c-myc表达的影响。方法：采用CCK8法检测苯扎贝特和非诺贝特（12.5、25、50、100、200 µmol/L）作用48 h对PC-9细胞存活率的影响。另将PC-9细胞分为给药组和对照组，给药组分别加入低、中、高浓度（25、50、100 µmol/L）的苯扎贝特和非诺贝特，对照组加入二甲基亚砜，作用48 h后，采用流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡情况;荧光定量聚合酶链法（qRT-PCR）检测细胞中c-myc mRNA相对表达量;Western blot法检测细胞中c-myc蛋白相对表达量。结果：上述浓度苯扎贝特作用下PC-9细胞存活率分别为（80.76±3.2）%、（74.35±5.06）%、（62.8±1.23）%、（59.03±1.55）%、（39.8±1.01）%;而非诺贝特作用下PC-9细胞存活率分别为（74.46±1.30）%、（61.91±4.77）%、（48.95±2.8）%、（37.05±1.55）%、（32.49±1.36）%。与对照组比较，苯扎贝特和非诺贝特的中、高浓度组G1期细胞比率均明显增加，苯扎贝特和非诺贝特的低、中、高浓度组的细胞凋亡率均明显增加，c-myc mRNA和蛋白相对表达量均明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：苯扎贝特和非诺贝特可抑制PC-9细胞增殖，并下调c-myc表达。

关键词 苯扎贝特;非诺贝特;肺腺癌PC-9细胞;半数抑制浓度;c-myc;抑制作用

Effects of Bezafibrate and Fenofibrate on the Proliferation of Lung Adenocarcinoma PC-9 Cells and the Expression of c-myc

WANG Guiping1，LIANG Jiecong2，LI Zhibin1，ZHANG Yantao1（1.Dept. of Pharmacy， Guangzhou Health Science College， Guangzhou 510180， China;2.Dept. of Surgery， Guangzhou Women and Children’s Medical Center， Guangzhou 510623， China）

ABSTRACT   OBJECTIVE： To study the effects of bezafibrate （BEZ） and fenofibrate （FEN） on the proliferation of lung adenocarcinoma PC-9 cells and the expression of c-myc. METHODS： The effects of BEZ and FEN （12.5， 25， 50， 100， 200       µmol/L） on the survival rate of PC-9 cells were detected by CCK8 method. PC-9 cells were divided into administration group and control group. Administration group was given low， medium and high concentration （25， 50， 100 µmol/L） of BEZ and FEN; control group was treated with dimethyl sulfoxide for 48 h. Cell cycle distribution and apoptosis were detected by flow cytometry. qRT-PCR was used to detect mRNA relative expression of c-myc in cells. The protein relative expression of c-myc in cells were detected by Western blot assay. RESULTS： The survival rates of PC-9 cells were （80.76±3.2）%， （74.35±5.06）%， （62.8±1.23）%， （59.03±1.55）%， （39.8±1.01）% under the action of above concentration of BEZ; and the survival rates of PC-9 cells were （74.46±1.30）%， （61.91±4.77）%， （48.95±2.8）%， （37.05±1.55）%， （32.49±1.36）% under the action of FEN. Compared with control group， G1 phase cell ratio increased significantly in medium and high concentration groups of BEZ and FEN; the apoptotic rate of PC-9 cells was increased significantly in low， medium and high concentration groups of BEZ and FEN; mRNA and protein relative expression of c-myc were decreased significantly， with statistical significance （P<0.05）. CONCLUSIONS： BEZ and FEN can inhibit the proliferation of PC-9 cells， and down-regulate c-myc expression.

KEYWORDS   Bezafibrate; Fenofibrate; Lung adenocarcinoma PC-9 cell; Half inhibitory concentration; c-myc; Inhibitory effect

肺腺癌（Lung adenocarcinoma）属于非小细胞肺癌（NSCLC），占所有肺癌的30%～40%，由于70%～80%的肺癌发现时已进展为晚期，故化疗仍是绝大多数肺癌患者主要的治疗手段[1]。但目前绝大多数肺癌患者化疗预后并不理想，总体5年生存率仅为10%～15%，肺癌的治疗药物主要包括铂类药物、第三代细胞毒药物（吉西他滨、紫杉醇、培美曲塞等）、表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂及EGFR单抗等[2-3]。因此，发现新的、更有效的、更安全的化疗药物，对延长肺癌患者的生存时间及降低死亡率有着迫切的临床需要。

贝特类药物如苯扎贝特（Bezafibrate）、非诺贝特（Fenofibrate）等具有降低三酰甘油、防止血液凝固、促进血栓溶解、减少动脉粥样硬化性炎症等作用，常用于动脉粥样硬化的预防和治疗[4]。近年来研究发现，贝特类药物也具有良好的抗肿瘤作用，如非诺贝特被报道对乳腺癌、肝癌、神经胶质瘤、前列腺癌等多种人类肿瘤具有良好的抗肿瘤作用[4-7];苯扎贝特被报道对白血病等肿瘤具有良好的抗肿瘤作用[8-9]。然而，目前有关苯扎贝特和非诺贝特抗肺癌的研究很少，本文主要研究苯扎贝特和非诺贝特对肺腺癌细胞PC-9增殖和c-myc表达的影响，为贝特类药物在肿瘤治疗中的应用提供依据。

1 材料

1.1 仪器

HERACELL150i型CO2培养箱、MK3型酶标仪和7500 型荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）仪（赛默飞世尔仪器有限公司）;Tanon-1600型凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）;22331 Hamburg型核酸蛋白測定仪（德国Eppendorf公司）。

1.2 药品与试剂

苯扎贝特对照品和非诺贝特对照品（美国Sigma公司，批号：B7273、F6020，纯度：>98%、>99%）;Cell Counting Kit8（CCK8）试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：C0038）;兔抗人c-myc单克隆抗体 （英国Abcam公司，批号：32072）;辣根过氧化物（HRP）标记的鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（上海康成生物工程有限公司，批号：KC-5G5）;HRP标记山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（经小鼠、人免疫球蛋白吸附）（美国Southern Biotech公司，批号：4050-05）;96孔聚苯乙烯酶标板（美国Corning公司）;胎牛血清、RPMI1640培养基及青链霉素（美国Hyclone公司，批号：SH30087.01、SH30809.01B、SH30010）;聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美国Millipore公司）;其余试剂均为分析纯。

1.3 细胞

人肺腺癌细胞株PC-9购自中山大学细胞库，培养于含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，并在37 ℃、5% CO2培养箱中培养，0.25%胰蛋白酶消化，传代备用。

2 方法

2.1 细胞增殖的检测

参考文献[10]方法，采用CCK8法检测细胞存活率，具体操作按说明书进行。取对数生长期PC-9细胞，以含10%胎牛血清的RPMI1640培养基制备单细胞悬液，接种于96孔培养板，细胞密度为5×105 L-1，每孔200 µL，试验设对照组、苯扎贝特组和非诺贝特组。将苯扎贝特和非诺贝特溶解于二甲基亚砜（DMSO）溶液（体积比为0.5%）中，然后用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至所需浓度。对照组细胞中加入DMSO溶液，苯扎贝特组细胞中依次加入12.5、25、50、100、200 µmol/L的苯扎贝特溶液，非诺贝特组细胞中依次加入12.5、25、50、100、200 µmol/L的非诺贝特溶液，作用48 h后，各孔加入CCK8混合液10 µL，37 ℃孵育3 h，在酶标仪450 nm波长处测定光密度（OD），试验重复3次。计算细胞存活率（%）=（加药组OD/对照组OD）×100%。

2.2 细胞周期与细胞凋亡率的检测

参考文献[10]方法，采用流式细胞法检测细胞周期与细胞凋亡率。 取对数生长期的PC-9细胞，调整细胞密度为1×106 mL-1，接种2 mL于6孔板内，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养12 h。试验设对照组，苯扎贝特低、中、高浓度组和非诺贝特低、中、高浓度组，对照组细胞中加入DMSO溶液，苯扎贝特低、中、高浓度组细胞中依次加入25、50、100 µmol/L的苯扎贝特溶液，非诺贝特低、中、高浓度组细胞中依次加入25、50、100 µmol/L的非诺贝特溶液，作用48 h后，经0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞悬液，然后加入70%冰乙醇5 mL混匀固定，4 ℃放置24 h以上。按试剂盒操作流程，加入碘化丙啶（PI）和膜联蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）-异硫氰酸荧光素（FITC），分别检测各组细胞周期与凋亡率。

2.3 细胞中c-myc mRNA表达的检测

采用qRT-PCR法检测细胞中c-myc mRNA表达水平。试验分组与给药情况同“2.2”项下方法操作，作用48 h后，收集细胞，加入1 mL Trizol缓冲液，抽提样品中总RNA，并对所提取的RNA进行纯度检测及总RNA完整性检测。反应条件：50 ℃ 2 min; 95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 32 s，40个循环。融解曲线分析：温度60～95 ℃，每个样品重复3次。以GAPDH为内参，荧光信号由ABI PRISM® 7500型qRT-PCR仪检测，最后按2ΔΔct法计算c-myc mRNA的相对表达量，ΔΔct=Δct给药组-    Δct对照组。引物序列与片段长度见表1。

2.4 Western blot检测c-myc蛋白表达

参考文献[11]方法，采用Western blot法检测细胞中c-myc蛋白表达水平。试验分组与给药情况同“2.2”项下方法操作，作用48 h后，收集细胞，细胞中加入100 μL裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟 ）进行细胞裂解，提取蛋白并测定总蛋白浓度。以10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，转PVDF膜，封闭后，加入兔抗人c-myc单克隆抗体（稀释比例：1 ∶ 10 000），4 ℃下放置过夜。洗膜后，将膜与HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（经小鼠、人免疫球蛋白吸附）（稀释比例：1 ∶ 10 000）共同孵育1 h后，将化学荧光发光底物均匀地加到膜的表面，并使反应持续5 min，暗盒显影。通过Image J软件分析目标条带灰度，以GAPDH为内参，计算c-myc蛋白相对表达量。

2.5 统计学方法

所有数据以x±s表示，应用SPSS 17.0统计软件进行分析，多组比较采用ANOVA方差分析，方差齐时采用LSD检验进行两兩样本之间的多重比较，方差不齐时采用Dunnett’s T3检验进行多重比较。P<0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 细胞存活率

12.5、25、50、100、200 µmol/L的苯扎贝特作用下PC-9细胞存活率分别为（80.76±3.2）%、（74.35±5.06）%、（62.8±1.23）%、（59.03±1.55）%、（39.8±1.01）%;而非诺贝特作用下PC-9细胞存活率分别为（74.46±1.30）%、（61.91±4.77）%、（48.95±2.8）%、（37.05±1.55）%、（32.49±1.36）%。苯扎贝特和非诺贝特均可不同程度降低PC-9细胞的存活率，并且苯扎贝特和非诺贝特的抑制作用呈浓度依赖性，随浓度的增加，其抑制作用也增强。与苯扎贝特组比较，非诺贝特对PC-9细胞的增殖抑制作用更强，其中浓度在25～100 µmol/L内两药的抑制作用差异具有统计学意义（P<0.05），12.5和200 µmol/L时两药的抑制作用差异无统计学意义（P>0.05）。不同浓度苯扎贝特和非诺贝特作用下PC-9细胞存活率曲线见图1。

3.2 细胞周期

与对照组比较，苯扎贝特中、高浓度组和非诺贝特中、高浓度组细胞中G1期细胞占比明显增加，差异具有统计学意义（P<0.05），苯扎贝特低浓度组和非诺贝特低浓度组细胞中G1期细胞占比无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。与苯扎贝特高浓度组比较，非诺贝特高浓度组细胞中G1期细胞占比明显增加，差异具有统计学意义（P<0.05）;两药低、中浓度组细胞中G1期细胞占比差异无统计学意义（P>0.05）。结果表明，苯扎贝特和非诺贝特均可诱导PC-9细胞产生G1期阻滞，阻滞诱导作用呈浓度依赖性，其中高浓度非诺贝特阻滞作用最明显。各组细胞的周期分布流式图见图2，不同周期细胞占比的检测结果见图3。

3.3 细胞凋亡

与对照组比较，苯扎贝特低、中、高浓度组和非诺贝特低、中、高浓度组细胞的凋亡率均明显增加，差异具有统计学意义（P<0.05），但凋亡率数值不大。与苯扎贝特组比较，相应浓度非诺贝特组细胞的凋亡率差异无统计学意义（P>0.05）。结果表明，苯扎贝特和非诺贝特均可诱导PC-9细胞凋亡，凋亡诱导作用呈浓度依赖性，但诱导作用不强。各组细胞凋亡的散点图见图4，凋亡率的检测结果见图5。

3.4 细胞中c-myc mRNA表达

与对照组比较，苯扎贝特低、中、高浓度组和非诺贝特低、中、高浓度组细胞中c-myc mRNA的相对表达量均明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。与苯扎贝特高浓度组比较，非诺贝特高浓度组细胞中c-myc mRNA的相对表达量均明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）;两药低、中浓度组细胞中c-myc mRNA的相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）。各组细胞中c-myc mRNA相对表达量的检测结果见图6。

3.5 细胞中c-myc蛋白表达

与对照组比较，苯扎贝特低、中、高浓度组和非诺贝特低、中、高浓度组细胞中c-myc蛋白相对表达量均明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。与苯扎贝特组比较，相应浓度非诺贝特组细胞中c-myc蛋白相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）。各组细胞中c-myc蛋白表达的电泳图见图7，蛋白相对表达量的检测结果见图8。

4 讨论

贝特类药物属于苯氧芳酸类降脂药，广泛应用于临床降脂治疗，对控制动脉粥样硬化、心血管疾病、缺血再灌注损伤等有较好疗效。贝特类药物也是重要的过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）α激活剂，PPARα受体通路与肿瘤发生关系密切。已有研究发现，非诺贝特等PPARα激活剂已被证实对多种人类肿瘤，包括肝癌、前列腺癌等肿瘤具有抗癌作用[4-12]。本研究结果显示，苯扎贝特和非诺贝特均可不同程度抑制PC-9细胞的生长和诱导PC-9细胞产生G1期阻滞，其中非诺贝特的抑制作用强于苯扎贝特。此外，试验也发现，苯扎贝特和非诺贝特可一定程度诱导PC-9细胞产生细胞凋亡，细胞凋亡诱导作用较弱，此与文献[13]报道一致，说明贝特类可能主要不是通过诱导细胞凋亡而产生抗肺腺癌作用。现有的研究也显示，非诺贝特等贝特类药物对不同肿瘤细胞凋亡诱导效应存在差异，例如非诺贝特对乳腺癌、肝癌、神经胶质瘤及前列腺癌的细胞凋亡诱导效应较明显[4-8]。

c-myc基因是myc基因家族的重要成员之一，主要参与细胞增殖、去分化、转化、细胞凋亡及细胞周期调控等生物学过程。c-myc在细胞周期调控中发挥重要作用，c-myc可通过多种方式影响细胞周期G1期关键点的调控，例如c-myc可直接活化细胞周期蛋白（Cyclin）D2和周期蛋白依赖性激酶（CDK）4，或是通过细胞分裂周期基因（CDC）25活化CDK2和CDK4，从而促进G1期进展到S期;相反，抑制c-myc的表达，则可阻滞细胞周期G1期进展[14]。本研究结果发现，苯扎贝特、非诺贝特两药均可不同程度下调c-myc mRNA和蛋白表达，其中非诺贝特对c-myc表达的抑制作用更明显，提示苯扎贝特和非诺贝特可能是通过下调c-myc的表达，从而阻滞PC-9细胞周期G1期进展。然而，贝特类药物抑制c-myc的表达是通过何种途径阻滞细胞周期G1期进展还需要进一步实验研究证实。目前，国内外学者的研究表明，非诺贝特可通过多种机制诱导细胞周期G1期阻滞，例如通过上调p21、p27/Kip1表达和下调Cyclin D1和Cdk4表达引起乳癌 MDA-MB-231细胞G1期阻滞[15];通过抑制蛋白激酶B（Akt）的磷酸化水平而诱导肝癌Huh7细胞产生G1期和G2期阻滞[16];通过抑制核转录因子κB（NF-  κB）和细胞外调节蛋白激酶（ERK）活性诱导肺癌A549细胞产生G1期阻滞[13]。

综上，苯扎贝特和非诺贝特可抑制PC-9细胞增殖，下调c-myc表达。

参考文献

[ 1 ] 林巍，李美霞，卢伟，等.埃克替尼治疗晚期非小细胞肺癌有效性与安全性的Meta分析[J].中国药房，2019，30（4）：533-537.

[ 2 ] CHENG TY，CRAMB SM，BAADE PD，et al. The international epidemiology of lung cancer：latest trends，disparities，and tumor characteristics[J]. J Thorac Oncol，2016，11（10）：1653-1671.

[ 3 ] VILLARUZ LC，BURNS TF，RAMFIDIS VS，et al. Personalizing therapy in advanced non-small cell lung cancer[J]. Semin Respir Crit Care Med，2013，34（6）：822-836.

[ 4 ] SKRYPNYK N，CHEN X，HU W，et al. PPARalpha activation can help prevent and treat non-small cell lung cancer[J]. Cancer Res，2014，74（2）：621-631.

[ 5 ] YOU BJ，HOUR MJ，CHEN LY，et al. Fenofibrate induces human hepatoma Hep3B cells apoptosis and necroptosis through inhibition of thioesterase domain of fatty acid synthase[J]. Sci Rep，2019.DOI：10.1038/s41598-019- 39778-y.

[ 6 ] SUN J，ZHENG Z，CHEN Q，et al. Fenofibrate potentiates chemosensitivity to human breast cancer cells by modulating apoptosis via Akt/NF-κB pathway[J]. Onco Targets Ther，2019.DOI：10.2147/OTT.S191239. eCollection 2019.

[ 7 ] TAO T，ZHAO F，XUAN Q，et al. Fenofibrate inhibits the growth of prostate cancer through regulating autophagy and endoplasmic reticulum stress[J]. Biochem Biophys Res Commun，2018，503（4）：2685-2689.

[ 8 ] MOLYNEUX E，MERRICK B，KHANIM FL，et al. Be- zafibrate and medroxyprogesterone acetate in resistant and relapsed endemic Burkitt lymphoma in Malawi; an open-label，single-arm，phase 2 study （ISRCTN34303497）[J]. Br J Haematol，2014，164（6）：888-890.

[ 9 ] HAYDEN RE，KUSSAIBATI R，CRONIN LM，et al. Be- zafibrate and medroxyprogesterone acetate target resting and CD40L-stimulated primary marginal zone lymphoma and show promise in indolent B-cell non-Hodgkin lymphomas[J]. Leuk Lymphoma，2015，56（4）：1079-1087.

[10] WANG G，YE Y，YANG X，et al. Expression-based in silico screening of candidate therapeutic compounds for lung adenocarcinoma[J]. PLoS One，2011.DOI：10.1371/journal.pone.0014573.

[11] PAN Y，FEI Q，XIONG P，et al. Synergistic inhibition of pancreatic cancer with anti-PD-L1 and c-myc inhibitor JQ1[J]. Oncoimmunology，2019，8（5）：e1581529.

[12] LAKSHMI SP，REDDY AT，BANNO A，et al. PPAR agonists for the prevention and treatment of lung cancer[J]. PPAR Res，2017.DOI：10.1155/2017/8252796.

[13] LIANG H，KOWALCZYK P，JUNCO JJ，et al. Differential effects on lung cancer cell proliferation by agonists of glucocorticoid and PPARalpha receptors[J]. Molecular Carcinogenesis，2014，53（9）：753-763.

[14] WANG XN，SU XX，CHENG SQ，et al. MYC modulators in cancer：a patent review[J]. Expert Opin Ther Pat，2019，29（5）：353-367.

[15] LI T，ZHANG Q，ZHANG J，et al. Fenofibrate induces apoptosis of triple-negative breast cancer cells via activation of NF-κB pathway[J]. BMC Cancer， 2014. DOI：10. 1186/1471-2407-14-96.

[16] YAMASAKI D，KAWABE N，NAKAMURA H，et al. Fenofibrate suppresses growth of the human hepatocellular carcinoma cell via PPARα-independent mechanisms[J]. Eur J Cell Biol，2011，90（8）：657-664.

（收稿日期：2019-06-19 修回日期：2019-09-10）

（編辑：邹丽娟）