MALDI-TOF/TOF质谱在本科开放创新实验中的应用

姜丽艳 闫国栋 刘文婧 孙硕 高贵

摘  要 介绍利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪建立一种快速分析水温对婴幼儿配方奶粉蛋白质的测定技术，考察水温对婴幼儿配方奶粉蛋白质的影响，旨在本科开放实验教学中引入大型仪器设备基质辅助激光解析电离飞行时间质谱，使学生认识水温对嬰幼儿配方奶粉蛋白质影响的同时，更熟练地掌握基质辅助激光解析电离飞行时间质谱的实验原理和操作技术，培养学生的科研能力和综合素质。

关键词 大型仪器设备;质辅助激光解析电离飞行时间质谱;开放创新实验;奶粉;水温

中图分类号：G642.423    文献标识码：B

文章编号：1671-489X（2019）04-0116-03

Abstract The technique of quickly analyzing the influence of pro-teins in infant formula milk powder diluted with water at different temperatures by MALDI-TOF/TOF MS， is established， and the effect of water temperatures on proteins in infant formula milk powderis studied. Through the open innovation experiment for undergra-duates by MALDI-TOF/TOF MS， students can get a deeper under-standing on the effect of water temperatures on proteins in infantformula milk powder. Meanwhile， students can master the experi-mental principles and techniques of MALDI-TOF/TOF MS. The stu-dents scientific research ability and comprehensive quality are trained.

Key words large-scale instrument and equipment; MALDI-TOF/TOF MS; open innovation experiment; milk powder; water temperature

1 引言

大型仪器设备是高校的优质资源，是培养创新人才的重要硬件基础[1-2]。但因大型仪器设备价格昂贵，维修成本高，操作烦琐及台件数少等瓶颈问题，致使目前本科实践教学中大型仪器设备的使用效益并不高[2-3]。为了充分发挥大型仪器设备在学生实践能力、思维创新能力和社会竞争能力培养中的作用，必须克服困难，充分挖掘大型仪器设备在教学中的各种功能，使大型仪器设备能够更好地为高素质人才培养服务，为本科学生的教学实践服务[4-5]。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF MS）用于多肽、蛋白质组学、核酸、糖类、药物和有机化合物等领域的研究，主要应用于生物大分子的定性和组织成像等方面的科研工作[6-8]。MALDI-TOF/TOF MS具有的灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段，并正发挥越来越重要的作用[9-10]。奶粉中的蛋白质多数为酪氨酸、乳清蛋白、乳球蛋白等大分子质量的蛋白，因此，用MALDI-TOF/TOF MS进行蛋白组分析及性质考察是一个很好的表征手段[11]。

2 实验原理

MALDI-TOF/TOF是一种软电离技术，不产生或产生较少的碎片离子。它可直接应用于混合物的分析，也可用来检测样品中是否含有杂质及杂质的分子量。分子量也是生物大分子如多肽、蛋白质等鉴定中首要的参数[12]。MALDI-TOF/

TOF的准确度高达0.1%～0.01%，远远高于目前常规应用的SDS电泳与高效凝胶色谱技术，目前可测定生物大分子的分子量高达600 kDa。基本原理是将样品分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，基质从激光中吸收能量，样品解吸附，基质—样品之间发生电荷转移，使得样品分子电离，电离的样品在电场作用下飞过真空的飞行管，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即通过离子的质量电荷之比（m/z）与离子的飞行时间成正比来分析离子，并测得样品分子的分子量[13]（图1）。

3 实验目的

1）利用基质辅助激光解吸电离技术建立一种快速分析水温对奶粉蛋白质影响的技术方法;2）系统考察水温对奶粉蛋白质的影响;3）熟练掌握基质辅助激光解析电离飞行时间质谱的实验方法及原理。

4 实验仪器与材料

实验设备  基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（AB公司5800）。

实验材料及试剂  市售婴幼儿配方奶粉（美素力金装1段、金领冠2段、合生元金装1段等）;α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白标准品，芥子酸（SA基质）（美国Sigma公司）;乙腈（色谱纯）;Milli-Q去离子水;三氟乙酸（TFA）。

5 实验方法

蛋白标准品的制备  取蛋白标准品20 mg，加入1 ml室温去离子水，配制为20 mg/ml浓度，充分涡旋后静置

5 min，使用时取上清液。

奶粉样品制备  平行称取合生元、美素佳儿、金领冠三份奶粉样品（1～3号）于5 ml离心管中，每份20 mg;分别加入1 ml室温、40 ℃、100 ℃水冲调制样，充分混匀后自然冷却;13 000 r，离心10 min，取中间清液于干净ep管中，待质谱鉴定。

配制SA基质溶液  用乙腈—水—0.1% TFA（4：5：1，V/V）溶解制成饱和溶液1 ml，充分涡旋后静置5 min，使用时取上清液。

点样  实验采用通常使用的混合点样法，即将基质与样品或标准品与基质按1：1（V/V）比例混合后直接点在靶板上，自然干燥，以能夠在靶板上形成淡黄色雪花状结晶薄层为宜。

质谱条件的选择  由于本实验考察的是蛋白质大分子受水温的影响情况，不需酶解处理，因此采用正离子线性模式进行MALDI-TOF/TOF MS的测定。设定分子量检测范围为5000～100 000 Da。激光在样品点上随机打击50个位置，每个位置上的激光打击次数为20。激光能量为5500～6000微焦。

数据对比匹配  牛奶中的乳清蛋白主要包括α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。根据样品质谱图和标准蛋白质SDS进行对比，研究不同的水温对奶粉蛋白质的影响。

6 实验结果

婴幼儿配方奶粉中主要蛋白种类和分子量测定  实验首先采用SDS-PAGE法分别测定市售的七种婴幼儿配方奶粉中蛋白质的种类和分子量，以便为后续的质谱实验选定分子量的检测范围和蛋白质分子量比对。实验发现市售的完达山、雀巢、金领冠、惠氏、美素佳儿、合生元和喜宝这七种婴幼儿配方奶粉中，大多含有酪蛋白、脂肪酸结合蛋白和乳球蛋白等，如图2所示。其中，κ-casein酪蛋白的分子量为19 000 Da，α-casein酪蛋白的分子量为23 600 Da，β-casein酪蛋白的分子量为24 000 Da，脂肪酸结合蛋白的分子量14 000～15 000 Da。

水温对婴幼儿配方奶粉蛋白质的影响  利用MALDI-TOF/TOF MS研究水温对金领冠、合生元和美素佳儿婴幼儿配方奶粉蛋白质的影响，实验结果见图3～图5。

由图3可见，不同温度的水对金领冠奶粉的蛋白质影响显著。用常温水时，金领冠奶粉中脂肪酸结合蛋白和β-casein酪蛋白的相对含量较高;而用40 ℃水冲泡时，β-casein酪蛋白和乳凝集素蛋白的相对含量显著增多，脂肪酸结合蛋白基本检测不到;100 ℃水时，主要的还是β-casein酪蛋白和乳凝集素蛋白，但相对含量都显著减少。

图4分析了不同水温对合生元奶粉蛋白质的影响。通过分析可以看出，用不同的水温冲泡合生元奶粉时，检测的大多为β-casein酪蛋白和乳凝集素蛋白，只是40 ℃水时，β-casein酪蛋白和乳凝集素蛋白的相对含量最高。

通过图5可见，水温对美素佳儿奶粉蛋白质的影响不显著，常温水和40 ℃水时，多为β-casein酪蛋白和乳凝集素蛋白;100 ℃水时，检测有脂肪酸结合蛋白。

可见，不同的水温对奶粉蛋白质的影响不同，但其影响没有特定的规律，根据奶粉的种类不同而具有差异。

7 结语

为了有效开阔学生的专业视野，提高大型仪器设备的共享效率，将大型贵重仪器MALDI-TOF/TOF MS引入本科学生的开放创新实验中，开设利用MALDI-TOF/TOF质谱快速分析水温对奶粉蛋白质影响的开放实验。实验前，学生自行查阅文献，撰写实验设计;按照设计内容，学生完成样品的准备和制备过程，样品测试分析在实验技术人员的引领下完成;在实验过程中，学生不仅了解水温对奶粉蛋白质的影响，而且有效地掌握MALDI-TOF/TOF质谱的相关测试手段，提高了科研能力，培养了创新思维。同时，有效完成了大型仪器设备向本科实验教学的延伸，进一步提高了大型仪器设备的优质资源共享效率。

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