基于种子无菌苗的云南甜龙竹组培快繁研究

郑祥亁 陈凌娜 孙茂盛 崔永忠 杨汉奇

(1 中国林业科学研究院资源昆虫研究所 昆明650233；2 西南林业大学竹藤研究所 昆明650233)

竹类植物是重要的林业种质资源， 2017 年中国以竹笋和竹材为主的竹产业产值达2 346 亿元， 成为国民经济中一项重要的产业[1]。 优质种苗是农林产业的基础。 传统的竹子育苗技术多见于扦插、 分篼、 埋秆、 埋鞭等， 这些技术存在母竹消耗多、 成本高、 繁殖系数低等问题， 因此快速高效的快繁技术越来越多地在竹子育苗研究中得到应用[2]。 目前，竹子的离体快繁技术已在多个散生和丛生竹种中取得成功[3-5]。

云南甜龙竹 (Dendrocalamus brandisii) 分布于缅甸、 越南、 老挝、 泰国以及中国云南中部和南部地区， 秆茎粗10～12 cm， 秆高10～15 m， 是优良的笋材两用大型丛生竹种， 其鲜食笋质好， 具有很高的经济价值[6]。 云南甜龙竹是云南栽种面积最广的笋用竹之一， 常用埋节或埋秆法育苗， 但其效率低、育苗成本高， 2008 年种苗价格达到20 ～30 元/丛，而且苗木质量不易控制， 极大地阻碍了该竹种的推广栽培。 由于罕见开花结实， 目前云南甜龙竹的快繁技术仅见以嫩芽为外植体材料的报道， 且增值系数较低[7]。 本研究以云南甜龙竹种子为实验材料，通过探索不同植物生长调节物质组合对其种胚无菌苗的丛生芽诱导、 增殖及生根的影响， 建立其离体快繁体系， 为促进云南甜龙竹种苗产业化生产、 显著减低苗木成本提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料

2018 年3 月在云南红河州采集成熟云南甜龙竹种子， 剥去稃片， 自然晾干， 选择健康饱满的种子于4 ℃冰箱保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 丛生芽诱导培养基的筛选

种子经灭菌[8]后， 接种于以MS 为基本培养基并含植物生长调节剂的培养基中， 植物生长调节剂为不同浓度的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA) 和6-糠氨基嘌呤(KT)， 分别设置4 种浓度梯度， 即6-BA，1.0、 2.0、 3.0 和4.0 mg/L； KT， 0.3、 0.6、 0.9和1.2 mg/L。 首先比较2 种常用细胞分裂素6-BA和KT 对丛生芽的诱导效果， 效果较好的6-BA 再与萘乙酸(NAA) 配合， 筛选最佳的浓度组合。 每个处理接种60 瓶， 每瓶接种2 粒种子， 重复3 次。

1.2.2 丛生芽增殖培养基的筛选

取长势和形态相似， 高约2.0 cm 的丛生芽， 分切为每2～3 个芽为一丛， 接种于含不同浓度水平的NAA、 6-BA、 噻苯隆(TDZ) 的MS 增殖培养基上，采用正交试验设计筛选适合丛生芽增殖的最佳培养基。 每种植物生长调节剂设置3 种浓度水平 (表1)， 每个处理接种45 瓶， 每瓶接种2 丛， 重复3 次。

1.2.3 试管苗生根培养基的筛选

将以上增殖的丛生芽(长约3 cm) 转接到含不同浓度的NAA、 吲哚丁酸(IBA) 及不同培养基的生根培养基上， 采用正交试验设计筛选最佳生根培养基。 每种植物生长调节剂和基本培养基设置3 种浓度水平(表2)， 每个处理接种45 瓶， 每瓶接种2丛， 重复3 次。

表2 试管苗生根试验的各处理水平

1.2.4 培养条件

各阶段培养基均含蔗糖30 g/L、 琼脂6.5 g/L，pH 值为5.9～6.3， 在不同培养阶段添加相应的植物生长调节剂， 培养环境为8 h 黑暗、 16 h 光照， 温度(25±2) ℃， 相对湿度80%。

1.3 数据统计与分析

丛生芽诱导、 增殖、 生根情况均在接种21 d 后分别统计。 诱导率、 增殖倍数、 生根率等指标按以下公式计算：

诱导率＝未污染且萌发丛生芽的种子数/ (接种种子总数-污染种子总数) ×100%；

增殖倍数＝增殖后芽苗的总数(＞0.5 cm) /接种时芽苗总数；

生根率＝生根苗数/ (接种苗数-污染苗数) ×100%。

数据分析由SPSS 17.0 软件完成。

2 结果与分析

2.1 植物生长调节剂对丛生芽诱导的影响

试验结果显示(表3)， 6-BA 对云南甜龙竹种胚苗丛生芽诱导效果显著高于KT， 并在浓度为3.0 mg/L 时诱导率最高， 为75.00%； 而KT 处理与对照没有显著性差异， 但经KT 处理后的幼苗高生长快，21 d 可达15 cm 左右， 而且节间较长， 每节5 cm左右。

表3 不同浓度6-BA 和KT 处理的种胚苗丛生芽诱导率

将浓度为3.0 mg/L 的6-BA 与不同浓度的NAA组合处理无菌苗丛生芽， 试验发现(表4)， 随着NAA 浓度的提高， 丛生芽的诱导率呈现先升高后下降的趋势。 NAA 浓度为0.7 mg/L 时丛生芽诱导率最高， 达86.33%， 且丛生芽长势良好。 因此， 云南甜龙竹丛生芽诱导的最佳培养基为MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.7 mg/L。

表4 6-BA+NAA 组合对云南甜龙竹无菌苗丛生芽诱导的影响

2.2 植物生长调节剂对丛生芽增殖的影响

试验结果显示(表5)， 9 个处理的增殖倍数最小为4.33 (处理9)， 最大为4.86 (处理5)。 极差R 值显示NAA、 6-BA、 TDZ 对丛生芽增殖的影响从大到小依次是： 6-BA＞NAA＞TDZ； 多重比较结果表明， NAA、 6-BA 处理中的水平1 和2 的丛生芽增殖倍数均显著高于水平3； 而TDZ 对丛生芽增殖倍数的影响不显著。 因此， 云南甜龙竹丛生芽增殖的最适培养基为MS + NAA 0.3 mg/L + 6-BA 6.0 mg/L +TDZ 0.001 mg/L。 以此培养基进行实验， 增殖倍数可达4.90， 且丛生芽的生长状态良好。

表5 不同浓度植物生长调节剂处理的丛生芽增殖情况

2.3 植物生长调节剂对丛生芽生根的影响

由表6 可见， 各处理的生根率(去掉受污染的丛生芽) 最小为59.35% (处理9)， 最大为69.96%(处理5)。 极差R 值显示， 6-BA 对其丛生芽生根率的影响最大， 其次是NAA， 而培养基的影响最小。 多重比较结果显示， NAA、 IBA 处理中的水平1 和2 对丛生芽生根率的影响均显著大于水平3， 而培养基对生根率的影响不显著。 由此， 云南甜龙竹丛生芽生根的最适培养基为1/2MS+NAA 2.0 mg/L +IBA 4.0 mg/L。 以此培养基进行实验， 其生根率为71.45%。

表6 不同浓度植物生长调节剂处理的丛生芽生根情况

3 结论与讨论

种子是竹类组织培养研究中最便利的材料， 容易得到具有强分化能力和活力的胚性外植体材料[2]。本试验利用不同的植物生长调节剂和培养基， 以实生无菌苗为外植体材料， 对云南甜龙竹的组培快繁技术进行了全面研究。 在云南甜龙竹丛生芽诱导方面， KT 没有明显的促进作用； 而6-BA 可以显著地提高丛生芽的诱导效果， 随着6-BA 浓度的升高，诱导率呈现先升高后降低的趋势。 这与以云南甜龙竹新萌发的嫩枝为外植体[7]以及慈竹(Neosinocalamus affinis)[9]丛生芽诱导的结果相似。另外， KT 处理的幼苗其高生长较快且节间较长， 这可能与KT 能够促进细胞分裂有关[10]。 另一方面，6-BA与NAA 配合使用会显著提高丛生芽的诱导率[11]， 本试验筛选出云南甜龙竹丛生芽诱导的最佳培养基为MS + 6-BA 3.0 mg/L + NAA 0.7 mg/L， 诱导率可达86.33%。 而以云南甜龙竹新萌发嫩枝为外植体[7]， 筛选出的丛生芽最佳诱导培养基为3/4MS +6-BA 2.0 mg/L + KT 1.0 mg/L， 但诱导率仅为72.7%。 这种差异可能是由于外植体以及外源激素的不同而引起的。

在云南甜龙竹丛生芽增殖过程中， 6-BA 对丛生芽增殖倍数的影响最大， 这与对慈竹、 小佛肚竹(Bambusa ventricosa) 的研究结果相似[11-12]。 其次NAA 也具有较好的效果， 这与慈竹的结果相似[11]；但NAA 对小佛肚竹丛生芽的增殖并没有显著影响[12]， 这可能是由于竹种差异以及外植体的内源激素含量存在差异， 从而造成其对外源激素的敏感程度不同。 本文筛选出的云南甜龙竹丛生芽最佳增殖培养基为MS + NAA 0.3 mg/L + 6-BA 6.0 mg/L +TDZ 0.001 mg/L， 增殖倍数可达4.90， 高于以新萌发的嫩枝为外植体的丛生芽增殖倍数 (最高4.50)[7]， 这可能是由于种子萌发的丛生芽生命活力较强所致。

丛生芽的生根培养是植物快繁的关键技术之一[13]。 本试验发现NAA、 IBA 对云南甜龙竹生根率有显著性影响， 最佳生根培养基为1/2MS + NAA 2.0 mg/L + IBA 4.0 mg/L， 生根率达到71.45%。 而同样采用NAA、 IBA、 培养基组合的生根培养基， 在其它竹种中却取得了较高的生根率， 如麻竹(Dendrocalamus latiflorus) 在1/3MS + NAA 3 mg/L +IBA 4.5 mg/L 中， 生根率可达90%以上[14]； 以云南甜龙竹新萌发的嫩枝为外植体诱导的丛生芽在1/2MS +NAA 3.0 mg/L + IBA 5.0 mg/L 中， 生根率约为75%～80%[7]。 造成本试验中云南甜龙竹生根率较低的原因可能由于竹种和外植体差异引起的[4，15-16]。 另外， 尽管种子是竹子组培研究中难得的外植体材料，但零星开花结实的竹子种子普遍存在自交衰退的现象， 部分种子表现出萌发率低、 生活力差[17-18]， 这也可能会导致种胚产生的快繁幼苗生根困难。

本研究通过1 年多的大量重复试验对云南甜龙竹种胚组织培养进行了详细研究， 获得了高增殖系数且长势较好的无菌苗； 不仅扩展了该重要经济价值竹种的育苗方法， 而且也为今后建立其遗传转化体系提供了试验基础。