Rab-3D在结直肠腺癌组织中的表达及临床意义

刘 佟，杨留勤，武莉萍，高国伟，吴冬梅，仁民柱，袁东方，董国艳

(新乡医学院第四临床学院放疗科，河南 新乡 453000)

结直肠癌是世界上常见的癌症之一，近年来，我国结直肠癌的发病率和病死率呈上升趋势[1-2]，其病理类型多数为腺癌，约40%的患者能在早期得到诊断[3]。目前，对结直肠癌患者的筛查多采用隐血试验，但其敏感性低，常导致漏诊，结肠镜检查已被公认为结直肠癌诊断的金标准，但因其操作具有侵袭性、患者常有疼痛等不适感及其价格昂贵限制了其使用。此外，几种血清标志物如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、糖类抗原19-9(carcinoembryonic antigen 19-9，CA19-9)和肿瘤特异性生长因子(tumor specific growth factor，TSGF)已被应用于结直肠癌的早期诊断，但它们诊断结直肠癌的临床效果仍存在争议[4]。虽然直肠癌的治疗方法在不断发展进步，但其治疗后总体5 a生存率仍无显著提高[5]。因此，寻找新的与结直肠癌发展、转移及预后相关的特异性标志物显得尤为重要。Rab蛋白是Ras超家族成员中最大的分支，参与调控真核细胞中囊泡介导的转运，家族成员包括Rab3、Rab-3A、Rab-3B、Rab-3C与Rab-3D，其中Rab-3D表达的蛋白为Rab-3D蛋白，Rab-3D与三磷鸟苷(guanosinetriphosphate,GTP)结合，在人体中广泛表达，尤其是在癌细胞系中表达明显增高[6]。有文献报道，Rab-3D在食管癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中高表达[7]。本研究应用免疫组织化学方法，分析Rab-3D在结直肠腺癌癌组织、癌旁组织及正常组织中表达情况及其与患者临床特征的关系，探讨Rab-3D在结直肠腺癌发生、发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2017年10月至2018年5月于新乡市中心医院行结直肠腺癌切除术患者的标本为研究对象。共纳入74例患者，其中男38例，女36例；年龄42～87(54.51±11.32)岁；直肠腺癌38例，结肠腺癌36例；肿瘤直径>5 cm者32例，≤5 cm 者42例；高分化腺癌8例，中分化腺癌50例，低分化腺癌16例；参照国际抗癌联盟(Union for International Cancer Control,UICC)2002标准，TNM分期Ⅰ+Ⅱ期45例，Ⅲ+Ⅳ期29例；无淋巴结转移45例，伴淋巴结转移29例。取患者术后腺癌组织及其配对的癌旁组织(距肿瘤组织边缘2～3 cm)(n=40)及正常组织(距肿瘤组织边缘>5 cm)(n=40)。所有标本经组织病理学检查确诊，患者术前均未接受放射、化学治疗和其他治疗，且未患其他恶性肿瘤。

1.2 主要试剂与仪器磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)、柠檬酸盐抗原修复液购自河南赛诺特生物技术有限公司,Rab-3D兔抗人单克隆抗体购自美国Abcam公司；免疫组织化学仪购自美国LEICA BOND-MAX公司,Leica组织切片机购自德国Leica公司,高速台式离心机购自珠海黑马有限公司,冷冻台、BM-IX生物组织包埋机购自孝感市宏业医用仪器有限公司,XK80-A快速混匀器购自江苏新康医疗器械有限公司,TPJ-A型摊片机购自常州市中威电子仪器有限公司,光学显微镜购自日本尼康公司,pH测试仪购自上海秋腾贸易有限公司,大、中、小枪头购自上海生工生物工程技术有限公司,低温冰箱购自重庆飞瑞电器有限公司。

1.3 免疫组织化学法检测各组织中Rab-3D表达取石蜡标本置于冰台上冰冻后切片,厚度3～5 μm，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水；PBS冲洗3次，每次5 min；放入抗原修复液(pH=6.0)的柠檬酸盐缓冲液中进行抗原修复；PBS冲洗3次，每次 5 min；将切片放入体积分数3%的过氧化氢溶液中，阻断内源性过氧化物酶的活性；PBS 冲洗 3 次，每次 5 min；每张切片加 100 μL 的Ⅰ抗(Rab3D抗体浓度：1200)，并取 PBS 100 μL 代替Ⅰ抗作为阴性对照，将其置入湿盒内，置于冰箱内4 ℃过夜；PBS冲洗3次，每次5 min；加生物素标记的抗兔二抗(浓度1200)，室温孵育60 min；PBS冲洗3次，每次5 min；每张切片滴加链霉亲和素-生物素-酶复合物；PBS冲洗3次，每次5 min；将切片放入3,3′-二氨基联苯胺显色工作液中；PBS冲洗3次，每次5 min；流水冲洗，苏木精复染后冲洗3次；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，PBS替代一抗作为阴性对照，光学显微镜下观察。

1.4 血清肿瘤标志物检测采集患者术前清晨空腹静脉血5 mL，4 000 r·min-1离心10 min，取上层血清，使用酶联免疫吸附法检测血清CEA、CA19-9、CA242、CA155水平。CEA>5 μg·L-1、CA199>27 U·mL-1、CA242>20 KU·L-1、CA155>35 KU·L-1为阳性。

1.5 结果判定采取双盲的方法，所有切片结果由3名病理科医生分别独立观察评分，结果取均值。染色强度计分：无着色为1分，淡黄色为2分，棕黄色为3分。阳性细胞百分比评分：阳性细胞0%～5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分,>75%为4分。最后将染色强度得分与阳性细胞百分比得分的乘积作为最终评分，总得分<6分为Rab-3D低表达，≥6分为Rab-3D高表达。

1.6 统计学处理应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计数资料用百分率表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组织中Rab-3D表达情况Rab-3D蛋白表达产物主要位于肿瘤细胞的细胞质中，呈褐色深染，在癌旁组织及正常组织中细胞质几乎未见染色(图1)。结直肠腺癌组织、癌旁组织和正常组织中Rab-3D高表达率分别为81.08%(60/74)、12.50%(5/40)和5.00%(2/40)；结直肠腺癌组织中Rab-3D的高表达率显著高于癌旁组织及正常组织，差异有统计学意义(χ2=49.381、60.584，P<0.05)；癌旁组织与正常组织中Rab-3D高表达率比较差异无统计学意义(χ2=0.626，P>0.05)。

A：结直肠腺癌组织；B：癌旁组织；C：正常组织。

图1 不同结直肠组织中Rab-3D表达(免疫组织化学染色,×100)

Fig.1 Expression of Rab-3D in different colorectal tissues(immunohistochemical,×100)

2.2 Rab-3D表达与结直肠腺癌患者临床病理特征的关系结果见表1。Rab-3D在结直肠腺癌组织中的表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤组织分化、肿瘤大小无关(P>0.05),与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和TNM分期有关(P<0.05)。

表1 Rab-3D表达与结直肠腺癌患者临床病理特征的关系

Tab.1 Relationship between Rab-3D expression and clinicopathological features in patients with colorectal carcinoma

临床特征nRab-3D低表达/例(%)高表达/例(%)χ2P性别 男384(10.53)34(89.47)3.5870.058 女3610(27.78)26(72.22)年龄 ≦60岁182(11.11)16(88.89)0.3920.531 >60岁5612(21.43)44(78.57)肿瘤部位 直肠389(23.68)29(76.32)1.1560.282 结肠365(13.89)31(86.11)肿瘤组织分化 高分化80(00.00)8(100.00) 中分化508(16.00)42(84.00)4.9420.084 低分化166(37.50)10(62.50)肿瘤大小 直径≤5 cm429(21.43)33(78.57)0.3990.528 直径>5 cm325(15.63)27(84.37)浸润深度 T1～24713(27.66)34(72.34)6.4610.011 T3～4271(3.70)26(96.30)淋巴结转移 是292(6.90)27(93.10)4.4930.034 否4512(26.67)33(73.33)TNM分期 Ⅰ+Ⅱ期4512(26.67)33(73.33)4.4930.034 Ⅲ+Ⅳ期292(6.90)27(93.10)

2.3 Rab-3D表达与结直肠腺癌患者血清肿瘤标志物的关系结果见表2。结直肠腺癌组织中Rab-3D表达与患者血清CEA水平有关(P<0.05)，与血清CA199、CA242、CA153水平无关(P>0.05)。

表2 Rab-3D表达与结直肠腺癌患者血清肿瘤标志物的关系

Tab.2 Relationship between Rab-3D expression and serum tumor markers in patients with colorectal cancer

肿瘤标志物nRab-3D低表达/例(%)高表达/例(%)χ2PCEA ≤5 μg·L-13411(32.35)23(67.65)7.4000.007 >5 μg·L-1403(7.50)37(92.50)CA19-9 ≤27 U·mL-1579(15.79)48(84.21)1.2280.268 >27 U·mL-1144(28.57)10(71.43)CA242 ≤20 KU·L-1456(13.33)39(86.67)2.8140.093 >20 KU·L-1183(16.67)15(83.33)CA155 ≤35 KU·L-1426(14.29)36(85.71)0.0100.922 >35 KU·L-1132(15.38)11(84.62)

3 讨论

目前，Rab家族的几个成员已经被证明在癌症的发生和发展中起着重要的作用。例如Rab-22A对结直肠癌的增殖、转移及化学治疗敏感性均有影响[8]，Rab-27A和Rab-27B已被证明是结直肠癌患者转移和预后的潜在预测因子[9-10]，Rab-40B是一种重要的蛋白质分泌调节剂，在胃癌、乳腺癌等多种类型肿瘤中起着促癌作用[11-12]。在人类乳腺癌和肺癌预后较差的表型中发现了Rab-3D对侵袭性生长和转移具有调节作用[13]。上皮间充质转换(epithelial mesenchymal transition,EMT)在肿瘤侵袭转移过程中起着不可替代的作用[14-15]。有研究发现，在结直肠癌中，Rab-3D通过介导Akt/GSK3β/Snail途径参与EMT的形成，故高表达的Rab-3D可能导致结直肠癌细胞的EMT过程[16]。YANG等[13]研究发现，Rab-3D在恶性肿瘤组织中的表达较高，在正常组织及良性肿瘤中表达较低，且与肿瘤癌变过程及TNM分期密切相关，TNM分期越高，Rab-3D的表达越高；另外，从正常组织到肿瘤边缘组织到肿瘤组织的变化过程中，Rab-3D蛋白的表达呈逐渐增高趋势，提示Rab-3D在肿瘤发展中起重要的作用，是肿瘤进展过程中重要的因子,可作为肿瘤治疗的靶点[17]。

本研究结果发现，结直肠腺癌组织中Rab-3D的高表达率显著高于癌旁组织和正常组织，Rab-3D的高表达与结直肠腺癌肿瘤浸润深度、淋巴结转移及TNM分期密切相关，提示Rab-3D在结直肠腺癌组织中的高表达与肿瘤的进展密切相关，Rab-3D可能具有致癌基因的某些特性，可促进肿瘤生长，加快肿瘤侵袭，可作为临床上评估结直肠腺癌的候选肿瘤标志物，可作为转移情况的预测指标之一。另外，Rab-3D的高表达还与肿瘤标志物血清CEA水平相关。研究表明，CEA是一种具有人类胚胎抗原特异性的酸性糖蛋白，定位于成熟肠细胞的根尖表面，在微绒毛的顶部，通过囊泡的运动使CEA“脱落”到排泄物中，而Rab-3D也参与调控真核细胞中囊泡介导的转运[6]，故二者的表达水平可能通过囊泡的运动相互影响，具体蛋白通路有待进一步研究。以上研究结果提示，可将Rab-3D与血清CEA作为早期诊断结直肠腺癌的重要肿瘤标志物。

综上所述，Rab-3D在结直肠腺癌中呈高表达，可作为诊断肿瘤的标志物，且Rab-3D高表达与结直肠腺癌患者肿瘤浸润的深度、淋巴结转移、TNM分期及血清肿瘤标志物CEA水平相关，可作为预测结直肠癌腺患者病情进展的指标，对结直肠腺癌患者的诊断及预后有着重要的意义。