海产品中4种副溶血性弧菌检验方法的研究

杨平　黄静敏　陈晶　刘小青　兰全学

摘要 分别采用国家标准MPN法、纸片法改良MPN法（R-MPN）和疏水网格滤膜法（HGMF）对50个海水及牡蛎样品进行检测。结果表明，R-MPN法和HGMF法的检出量比另外2种方法高，差异显著（P<0.05）。纸片法的特异性最高，其次是HGMF法，R-MPN法和MPN法的特异性相对较低：本文通过比较4种副溶血性弧菌检验方法的检出量和特异性，以期为今后的检测方法改进提供参考。

关键词 副溶血性弧菌;MPN法;纸片法;改良MPN法;疏水网格滤膜法（HGMF）

中图分类号 TS201.3

文献标识码 A

文章编号 1007-5739（2019）08-0238-02

副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性嗜盐菌，常见的食源性致病菌"。尤其在沿海地区，自1998年来副溶血性弧菌引起细菌性食物中毒危害已取代沙门氏菌12。由于副溶血性弧菌广泛存在于海水以及鱼、虾、蟹、贝类和海藻等海产品中，近年来随着保鲜和物流业的迅速发展，海产品得以运输到内陆销售，而副溶血性弧菌污染地区范围正随着海产品消费范围的扩大而扩大B。副溶血性弧菌对环境条件很敏感，海产品从沿海运输到内陆一般都是采取冷冻保鲜等方式，在此过程中副溶血性弧菌易发生亚致死损伤4。但只要环境适宜，损伤的副溶血性弧菌会发生复苏，这对水产品的食品安全造成了潜在的危害。人们在食用被副溶血性弧菌污染的水产品后，极易引起急性肠胃炎。少数严重病人会产生休克、昏迷而死亡。污染范围及保藏运输条件等变化无疑对海产品的质量安全监控形成新的挑战。检测手段也应对新变化做出适当调整，结合检验方法的特点综合运用。

目前，我国建立的副溶血性弧菌国家标准定量检测方法为GB4789.7-2013。MPN法是最常用的细菌定量检测方法，但其得出的结果是样本中活菌数量的最大或然数，属于间接的半定量分析方法，而且操作过程繁琐。美国FDA采用的是HGMF法，通过疏水网格滤膜过滤截留样品中的细菌，再进行选择性培养，得到的结果以CFU/g（mL）为单位，是一种直接定量法。自20世纪70年代发展至今，HGMF已成功应用于各种食源性致病菌的检测中15-7。此外，本实验室已建立了疏水滤膜快速定量方法8以及Ray等建立的改进MPN法（R-MPN），但不同检测方法利用菌的某个特性对细菌进行检测，都有其优缺点，没有一种方法能确保100%准确，只能综合考虑样品性质等情况，选择某种方法或联合使用。因此，本文通过对4种副溶血性弧菌定量方法进行探讨研究，综合考虑方法的优缺点，以期为更好地控制副溶血性弧菌引发的食源性疾病提供参考依据。

1试验材料

1.1样品采集

50个海水以及新鲜或冰冻的牡蛎采集于深圳市的海鲜市场、农批市场、超市等。采集300mL海水样品置于500mL无菌广口瓶中，牡蛎样品采集后立即置于4C冰箱保存，24～48h内完成测试（通常24h内）;冷冻样品置于-18C冰箱保存。

1.2培养基和试剂

培养基和试剂包括蛋白胨/吐温80（PT）、蛋白胨/吐温80/3%NaCl（PTS）、副溶血性弧菌显色培养基（VPCM，法国科玛嘉）、大豆酪蛋白琼脂（TSA）、3%NaCl大豆酪蛋白琼脂、胰化大豆硫酸鎂琼脂（TSAM）、3%NaCl胰化大豆硫酸镁琼脂（TSAMS）、ISO-GRID疏水网格滤膜（NEOGEN）、副溶血性弧菌鉴定纸片。

2试验方法

2.14种检验方法

2.1.1国家标准MPN法。根据《食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》（GB4789.7-2013）要求进行。

2.1.2改良MPN法（R-MPN法）。R-MPN法是Ray等在原有MPN法的基础上增加一步预富集过程，即先经过胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）预富集2h后，接着在3%NaClTSB培养过夜，有利于副容血性弧菌受损细胞的修复，再通过阴离子葡萄糖盐肉汤（GST）36C培养过夜，鉴定。

2.1.3纸片法。把样品稀释液接种副溶血性弧菌鉴定纸片，于42C条件下培养24h，按照产品说明书计算阳性菌落数。

2.1.4疏水网格滤膜法（HGMF法）。通过疏水网格滤膜过滤截留样品中的细菌，然后把滤膜放置在TSAMS培养基上36C修复4～5h后，转到副溶血性弧菌显色培养基上36C选择性培养过夜，计数。

2.2副溶血性弧菌检测

海水样品：海水样品采用上述4种方法来进行检测，MPN法和R-MPN法选择10.0、1.00.1mL3个稀释度;纸片法均吸取1mL样品;HGMF法选择100.0、10.0、1.0mL3个稀释度。

牡蛎样品：称取25g样品加入225mL3%氯化钠碱性蛋白胨水内，均质器拍打混匀制成1：10均质液，采取，上述4种方法对均质液进行定量检测。MPN法R-MPN法选择10.0、1.0、0.1mL3个稀释度;HGMF法选择1.000.10、0.01mL3个稀释度;纸片法均吸取1mL样品。

所有试验样品均做3个平行，检测结果以几何平均值表示。

2.3菌株鉴定

分别从4种方法的培养物中根据菌落形态挑取50个可疑菌落划线纯化，纯培养的单菌落进行氧化酶试验、3%NaCl三糖铁琼脂试验和嗜盐性试验。采用VITEK2Compact全自动细菌鉴定系统对菌株进行确证鉴定。

2.4统计分析

采用SPSS19.0对数据进行统计分析。

3结果与分析

海水样品和牡蛎样品中副溶血性弧菌的定量检测情况如表1所示。通过对比4种检验方法，可以看出，4种检验方法中，R-MPN法和HGMF法对于海水样品和牡蛎样品的检出量较高，而且2种方法之间差异无统计学意义（P>0.05）。HGMF法对于海水样品和牡蛎样品的检出量最高，其次是R-MPN法，MPN法和纸片法检测量相对较低。从海水样品的检测结果来看，4种检测方法的检出量之间没有统计学差异（P>0.05）。而对于牡蛎样品，R-MPN法和HGMF法的检出量之间没有统计学差异，但这2种方法的检出量都明显高于纸片法和MPN法（P<0.05）。牡蛎样品中副溶血性弧菌的检出量基本比海水样品的数量高出2个数量级。

分别从4种方法中随机挑取50个副溶血性弧菌可疑菌落，采用VITEK2Compact全自动细菌鉴定系统对菌株进行鉴定来检验这几种方法的特异性。可疑菌落的挑取主要根据菌落的形态特征，没有采用其他生化手段作为辅助。纸片法的阳性率为98%，HGMF法的阳性率为85%，而采用R-MPN法和MPN法的阳性率分别为60%和66%，采用纸片法和HGMF法的特异性明显高于R-MPN法和MPN法（P<0.05）。

4结论与讨论

比较4种副溶血性弧菌检验方法的检出量，R-MPN法和HGMF法中副溶血性弧菌的检出量较另外2种方法高，可能因为这2种方法都对副溶血性弧菌受损细胞有一个修复的步骤，R-MPN法和HGMF法首先通过在没有选择性的培养基中培养一段时间再进行选择性培养，能有效修复冷藏或冷冻过程中被损伤的副溶血性弧菌细胞。Ray等研究经过冷藏或冷冻处理的副溶血性弧菌受损细胞的修复，发现在TSB培养2h后，接着在3%NaClTSB培养过夜，是一个非常有效的MPN计数法前修复处理方法。通过前期试验结果也发现在TSAMS上培养4～5h后，能有效修复副溶血性弧菌受损细胞。此外，不同取样量也会影响结果的检测量。如海水样品，HGMF法1次共检测11.0mL样品，而MPN法1次只检测33.33mL样品量。对于牡蛎样品，因为1：10均质液容易堵塞滤膜，所以HGMF法的样品总分析量降为0.11g。此外，复杂的数学换算也会对检出量有一定影响。R-MPN法和MPN法得出的结果是活菌数量，得到的值单位为MPN/g（mL），可通过公式换算成CFU/g，但跟实际菌含量有一定差别。

从4种副溶血性弧菌检验方法的特异性结果来看，纸片法和HGMF法检测副溶血性弧菌的特异性比MPN法及R-MPN法好。纸片法是在42C条件下培养的，研究表明，提高检测温度能有效抑制其他微生物的生长。然而，纸片法的特异性虽然高，但是该方法的检出量却很低，容易出现漏检的情况，尤其对于在运输等过程中产生损伤或致死的细胞。HGMF法的特异性比纸片法稍低，但检出量高，对损伤细胞也有很好的修复步驟，不容易出现漏检的情况。R-MPN法和MPN法的方法特异性相当。

除了考虑方法的检出量和特异性外，方法的效率性也非常重要。纸片法无需配制培养基，而且操作简单，可减少生化鉴定步骤，快速简便。HGMF法可以同时过滤多个样品，同时可以缩短富集培养的时间。R-MPN法和MPN法用于微生物计数时包括富集、分离和鉴定等所有步骤，不论是用3管6管还是9管MPN法，每个稀释管都要经过以上各个步骤，需要大量的培养基和培养步骤，操作过程略为繁琐，其得出的试验结果是样本中目的菌活菌数量的统计学估计值。

综合考虑4种方法的优缺点，应根据样品和检测要求等，结合方法的特点综合运用。如在突发公共卫生事件中，纸片法快速简便，更具优势。MPN法虽然繁琐，但该方法是目前国家标准检定副溶血性弧菌的定量方法，检测结果得到国家检定结构和企业等的认可。相比于MPN法，HGMF法处理大量样品，使受损细胞得以生长并被检出，检出量高，特异性好，可为今后改进国家标准法提高检验效率提供一定参考。

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