类雌激素农药咪鲜胺对哺乳动物的生殖毒理研究进展

唐涛　周威　晏姣　戴清香　谭显胜　金晨钟　胡军和

摘要 目前，类雌激素农药对生态系统和人口健康造成的危害日益受到人们的关注。类雌激素农药会影响雌性哺乳动物的内分泌系统，导致生殖和发育方面的畸形。本文就类雌激素农药的概念及其对雌性哺乳动物的毒性作用，并着重从咪鲜胺的类雌激素作用机制、检测方法和今后研究趋势3个方面进行阐述，以期对于同行研究类雌激素农药对哺乳动物生殖毒理方面的研究有一定借鉴意义。

关键词 类雌激素农药;咪鲜胺;哺乳动物;生殖毒理

中图分类号 S481.1

文献标识码 A

文章编号 1007-5739（2019）08-0223-03

农药是广泛应用于害虫和病害控制的主要化学品，仅就农业用途而言，欧盟每年使用杀虫剂超过14万t，大量应用杀虫剂会引起人们对农药危害人类健康的担忧，如生殖安全的担心，包括目前人类不孕发病率的逐年，上升也与之相关。为了提高农业生产效率，农药被人们长期和大量使用”，对环境造成十分严重的污染，特别是有些农药中含有类似雌激素的成分，可能影响动物甚至人的内分泌功能。

咪鲜胺是一种新型咪唑类高效广谱杀菌剂2，通用名为Prochloraz，又叫卜菌唑、扑霉唑，具有触杀性和内吸性，通过抑制麦角幽醇的生物合成，从而破坏菌体细胞膜功能而起作用”。研究表明，咪鲜胺在体外引发多种作用机制，因为它拮抗雄激素和雌激素受体，并抑制芳香酶活性。总之咪鲜胺是一种类雌激素农药，其有关的干扰内分泌作用机制、检测技术和今后研究方向方面的论述还不是很系统。因此，本文就咪鲜胺对于哺乳动物生殖毒理方面的研究予以综述，期望对该领域今后的研究有一定的意义。

1咪鲜胺的类雌激素作用机制的研究

类雌激素农药咪鲜胺也是一种内分泌干扰物（endocrinedisruptingchemicals，EDCs），能够干扰正常内分泌激素生物合成4。许多EDCs具有类似雌激素活性并干扰由雌激素受体（estrogenreceptors，ER）介导的正常雌激素信号传导作用5。EDCs可以通过与ER直接作用，间接通过芳香烃受体等转录因子或通过调节对正常雌激素合成和代谢至关重要的代谢酶，来调节和修饰基因组和非基因组ER的活性，从而影响雌激素的功能。虽然受体结合内源性雌激素17β一雌二二醇（Estrogen2，E2），具有相似的亲和力，但许多外源性配体已显示出对ER的选择性间。通常，EDCs通过多种机制起作用，包括通过激活其他转录因子，最显著的是芳香烃受体的间接作用，或通过雌激素代谢的修饰。具有上述类似雌激素功能，并且干扰正常内分泌功能的农药称之为类雌激素农药，目前使用比较广泛67。

某些类雌激素农药与激素有类似的化学构象，可以和激素受体直接结合，形成配体受体复合物，复合物再结合到细胞核DNA结合域的雌激素反应元件上，诱导或抑制有关调节细胞生长和发育的靶基因的转录8。而某些物质可竞争性结合雄激素受体，虽然二者结合后无生理活性，但由于该类物质占据了正常激素的结合位点，使之无法与受体结合从而减弱了正常的激素效应四。咪鲜胺是羊毛甾醇14a一脱甲基酶（lanosterol14a-demethylase或CYP51A1）的抑制剂，它是从羊毛甾醇中生产麦角甾醇（真菌细胞膜的必需成分）所必需的，而羊毛甾醇14x一脱甲基酶是一种细胞色素P450酶，参与羊毛甾醇转化为4，4-二甲基胆甾醇-8（9），14，24-三烯-3B-醇。

咪鲜胺有较弱的抗雄激素活性，能够拮抗外周雄激素受体，减缓雄激素依赖性组织的生长发育;还能够拮抗中枢雄激素受体，阻断睾酮负反馈调节机制，引起脑垂体促黄体生成素分泌增多叫。类雌激素农药对男性的影响尤为突出，表现为性腺发育不良、生殖道肿瘤和先天畸形增多。

因此，咪鲜胺也是一种新型内分泌干扰物，主要拮抗相关生殖激素受体发挥作用，因为它引发双重作用机制并且通过阻断雄激素受体和抑制胎儿类固醇生成起到抗雄激素的作用。体内咪鲜胺通过降低生殖器官的重量，影响前列腺中雄激素调节的基因表达和增加促黄体激素水平素。

2农药咪鲜胺类雌激素作用的檢测方法

2.1整体动物试验

一般整体动物试验是通过动物试验研究相关农药受试物对哺乳动物生殖功能和发育过程的影响，预测其可能产生的对生殖细胞、受孕等的不良影响。对于雌性动物的测试，较经典的方法有子宫增重试验1和阴道细胞角化试验;此外，还有过氧化物酶活力测定8及子宫血管渗透性试验凹。体内试验的关键在于选择合适的试验动物和易于检测的生理指标。如鱼类卵黄蛋白原诱导试验，就是根据正常雄性体内不会含有卵黄蛋白原，在大剂量人工雌激素作用下以及在低剂量类雌激素长期作用下，都能诱导体内卵黄蛋白原的生成，从而检测经类雌激素农药作用后的雄鱼体内的卵黄蛋白原的含量来评价其毒性。有研究者提出一套将日本青锵胚胎和幼鱼暴露于排放污水中，通过对暴露后的胚胎损坏死亡情况、孵化率、孵化时间、幼鱼畸形、平游失败率、生长（体重、体长）、性别比率和死亡率等指标进行观察和统计，从而评价排放污水的毒性和内分泌干扰效应的方法。

总之，虽然体内试验法的结果可靠，但是要求大量的动物毒理学试验，需要以牺牲大量的试验动物为代价，并且花费大量的人力物力，而且持续周期较长。同时，不同种类的试验动物，不同生长阶段的同一种试验动物对同一类雌激素农药均可能表现出不同的试验结果。因此，经体内试验法得出的结论也有一定的局限性。

2.2离体细胞试验方法

乳腺癌细胞7细胞（breastcancercells，MCF-7）来源于人乳腺癌细胞，其雌激素受体表达阳性，具有雌激素依赖性，并在暴露于雌激素化学物质后迅速增殖，广泛应用于类雌激素农药活性的评价2。因此，通过雌激素受体（ER）依赖性MCF-7细胞增殖试验可以检测农药的雌激素活性2。具体的操作方法如下：将MCF-7细胞接种在含有细胞基础培养液的6孔培养板中，在生长培养基中孵育24h后，用试验培养基（含有待检测物质的基础培养液）代替原有的基础培养基继续培养6d，然后统计细胞数，从而研究其添加物对于MCF-7细胞生长的影响。另外，还可以检测其对照组和不同试验组培养液中雌激素水平的变化，最终决定其检测物质的抗雌激素作用强度。

另外，还有E-SCREEN方法，就是试验以利用雌激素对其靶细胞的增殖作用作为终点来评估环境化学物质的雌激素性，该定量测定法比较了在没有雌激素（阴性对照）和存在17β-雌二醇（阳性对照）和一系列怀疑是雌激素的化学物质的情况下通过相似的MCF-7细胞接种物获得的细胞数。目前，研究发现E-SCREEN测定法可以用来测量类雌激素农药对于生殖方面的影响。具体方法是，用一系列浓度的化学品或目的样品处理后，使用E2作为阳性对照，研究MCF7细胞的增殖情况。使用该测定法，发现多种化合物是雌激素的类似物，如烷基酚、邻苯二.甲酸酯咪鲜胺等。进一步研究显示，这些化合物可以结合ER并激活MCF7细胞中pS2（一种雌激素应答基因）的转录3E-SCREEN这样的增殖试验可能是高度敏感的，并且结果可能具有相关性，因为该系统利用表达可能介导雌激素效能的内源共激活因子的人源细胞。最近有研究报道，利用该技术进行了玉米赤霉烯酮及其衍生物的雌激素活性研究，测量暴露于这些霉菌毒素的ER阳性人乳腺癌细胞（MCF-7）的增殖，进一步发现，在6.25～25.00μM水平暴露后，通过使用E-Screen生物测定评估细胞增殖，其结果显示了玉米赤霉烯酮及其衍生物在MCF-7细胞中的雌激素活性0。

2.3分子生物学方法

荧光素酶报告基因系统是以荧光素为底物检测萤火虫荧光素酶活性的一种报告系统，荧光素酶可以催化荧光素氧化成氧化荧光素，其间会发出生物荧光，然后可以通过荧光测定仪测定荧光素氧化过程中释放的生物荧光07-18。可见，荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以灵敏、高效地检测基因的表达，是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法"8。目前，按照整个方法技术体系，构建了雌激素受体亚型介导的荧光素酶报告系统，开发了使用荧光素酶报告基因系统的人类雌激素受体（hERalpha）和hERbeta介导的报告基因测定，结果hERalpha报告基因系统对E2的最低检测限为1.9x10-11mol/L，在1.9x10-8mol/L处获得最高诱导倍数，是对照组的30.7倍。

分子生物学方法快速、灵敏、特异性高，使类雌激素农药体外检测试验更易实现，可操作性强。用其他激素类受体（如雄激素受体、孕激素受体）替代该体系中的雌激素受体，就可以构建检测环境雄激素和环境孕激素的试验体系。因此，该方法的推广性好。

3今后研究方向

农药残留弓发的问题涉及医疗、饮食建筑、造船、水产养殖等各行各业021，目前，对雌激素作用机制尚不清楚，对环境污染物雌激素生物活性的研究还处于探索性研究阶段，仅可以根据有限的试验数据推测哪些环境污染物可能具有雌激素活性，尚无足够的在人体中负面效应的证据。因此，类雌激素农药作用机制的深人研究对了解和确定一种环境污染物的雌激素性质十分必要。另一个研究方向即研究更多的化学品和其他压力因素及其潜在累积影响。多年来，毒理学家倾向于避免研究累积效应，因为它被认为是一个棘手的问题。对于激素活性劑来说尤其如此，因为有大量的配体和多种来源，其中不仅包括人造化学物质，还包括植物中的化合物、内源性激素，甚至非化学应激物。最后，这方面的未来研究需要不断拓展，这意味着关于内分泌系统特定组分的信息（例如特定的细胞培养反应）需要在全身生理学的背景下进行解释2。

随着分子生物学试验方法的渗透、人类基因组计划中人类基因图谱的绘制完善，生物芯片中毒理芯片的研究很快将成为毒理学研究的前沿2-24，建立科学准确的环境污染物雌激素活性筛选方法、充分利用人类基因组计划研究结果进行毒理芯片的研究是最理想的切人点。

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