一种水环境eDNA提取方法的建立

黎慧 阚霞 魏宁

摘要 [目的] 建立高效实用的水样环境DNA提取方案。[方法] 采用滤膜法和沉淀法对2个不同大小的水域进行eDNA提取并对所获得的eDNA进行PCR扩增。其中，滤膜法设置50、100、200 mL 3个水样体积试验组，每组3个平行；沉淀法设置10、20、40 mL 3个水样体积试验组，每组3个平行。[结果] 大型水塘水样经滤膜法处理后获得的eDNA浓度更高；小型水池采用滤膜法和大型水塘采用沉淀法处理水样后经PCR检测可获得更明显的扩增结果。[结论]该研究建立的滤膜法和沉淀法可用于不同水环境eDNA的提取。

关键词 环境DNA提取；水环境；滤膜法；沉淀法

中图分类号 S181 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）09-0108-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.032

Abstract [Objective] To establish an efficient and practical method for extracting environmental DNA （eDNA） from water sample.[Method]Using the filter membrane or precipitation method to extract eDNA from two different sizes of water body and conducting PCR amplification to detect the quality and quantity of eDNA.Four groups were set with different water volume 50，100，200 mL and negative control in filter membrane method.And the other four groups with water samples 10，20，40 mL and negative control were set in precipitation method.All groups have three parallel samples.[Result]The concentration of eDNA extracted by the filter membrane method from the large water body was higher than others.The eDNA from small and large water body handled by the filter membrane and precipitation methods respectively can be detected significantly by PCR amplification.[Conclusion]The methods used in this study can be applied to eDNA extraction in different water bodies.

Key words Environmental DNA extraction； Water sample； Filter membrane method； Precipitation method

环境DNA（Environmental DNA，eDNA）是指从环境样本中如土壤、沉积物、空气、水体等所提取到的DNA[1]。它是来自微生物、动物、植物等多个不同物种的混合DNA，既包含了从生物体脱落或释放到环境中活细胞的DNA，也包括由于生物体死亡后的腐烂尸体所裂解释放到环境中的胞外DNA[2]。与传统方法相比，环境 DNA法仅需从目标研究物种潜在分布区域中采集土壤或水样等物质，而不需要捕捉、干扰或伤害动物体，故该方法被广泛地应用于外来入侵物种的监测[3-4]和珍稀濒危动物的分布调查[5]；其次，由于环境DNA是多个物种的混合DNA，因此该方法也常被应用于生物多样性的研究[6-7]。近年来，随着环境DNA技术的逐渐成熟和发展，环境 DNA还被用于水生生物量的估计[8-9]、动物的食性分析[10]、种群大小[11]和种群动态[12]等方面的研究。

水样作为环境DNA研究的样本类型之一，其主要分析步骤为水样的采集与保存、水环境eDNA的提取、水环境eDNA的分析。其中，水环境eDNA的提取非常关键，已有研究显示不同的水样采集方法和提取方法对eDNA的产量和质量影响显著[13]。当前，通常采用试剂盒法、滤膜法或沉淀法来进行环境DNA的提取。其中，试剂盒法提取的环境DNA质量和产量均较好，然而由于其成本相对较高，因此不适用于对大规模的样本开展研究。笔者分别采用滤膜法和沉淀法对大型水塘和小型水池中的环境DNA进行提取，比较了所得eDNA的产量和质量，并據此建立了高效实用的水环境eDNA提取方法。

1 材料与方法

1.1 水样采集及处理

选取某大型水塘（约560 m2）和某小型水池（约6 m2）作为该研究水样的采集地点。大型水塘除面积较大外，还生活着多种鱼类、鸟类和植物；小型水池面积较小，总体呈长方形，水质较清澈，基本无动植物分布。

大型水塘水样的采集：绕湖一周，随机选取20个采样点，每个采样点取表层水约100 mL，然后混匀倒入同一个容器后带回实验室进行后续处理。

小型水池水样采集：选取水池的4个角和水池中央部分表层水进行采样，每个采样点约取400 mL，将水样混匀后倒入同一个容器带回实验室进行后续处理。

将2个采样地点的水分成2部分，一部分用于滤膜法提取eDNA，一部分用于沉淀法提取eDNA。水样的具体分组情况见表1。

1.2 水环境eDNA提取

1.2.1 滤膜法。

用孔径为0.45 μm的混合纤维素滤膜（上海市新亚净化器件厂）抽滤各组水样。每次抽滤结束后，用无菌的镊子取出滤膜，折叠卷紧后剪碎放入2 mL离心管中，加入900 μL DNA抽提液和10 μL蛋白酶K（10 mg/mL）于56 ℃恒温水浴过夜。随后12 000 r/min离心5 min，吸取400 μL上清液转移到一个新的2 mL离心管中，用等体积酚/氯仿/异戊醇 （25∶24∶1） 抽提2次，10 000 r/min离心10 min，将300 μL上清液转移到新的2 mL离心管中，加入0.6倍体积异丙醇室温沉淀1 h，12 000 r/min离心15 min，弃上清液，在沉淀中加入1 mL 70%乙醇洗涤沉淀2次，12 000 r/min离心10 min，弃上清，待乙醇挥发后加入30 μL TE溶解DNA。

1.2.2 沉淀法。

将各组水样置于4 000 r/min下离心15 min，弃上清，仅余1 mL上清液悬浮沉淀，吹打混匀后转移到2 mL离心管中，12 000 r/min离心5 min，弃上清，在管中加入900 μL DNA抽提液和10 μL蛋白酶K（10 mg/mL），后续DNA提取方法同“1.2.1”。

1.3 环境DNA检测 以提取的各组eDNA为模板，利用细菌16S rDNA通用引物（F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；R：ACGGCTACCTTGTTACGACTT）[14]对eDNA进行PCR扩增，整个PCR操作过程在超净工作台上进行。PCR反应体系为20 μL，含2.0 mmol/L的MgCl2，0.25 mmol/L的dNTP，0.2 μmol/L的上下游引物，1 U的Taq聚合酶，模板DNA 0.8 μL，10×Buffer 2 μL，双蒸水补足到20 μL。反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s；60 ℃退火40 s；72 ℃延伸90 s，共30个循环；最终72 ℃下延伸10 min。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

2 结果与分析

2.1 各组eDNA提取结果

经滤膜法和沉淀法处理后的环境水样在eDNA的提取结果中存在明显的差异（图1）。对于大型水塘采用滤膜法处理后的3个试验组分别在琼脂糖凝胶电泳检测中得到了明显的目的条带，而在其他试验组以及4个对照组中均没有明显的目的条带。说明在大型水塘中采用滤膜法可很好地富集水样中的DNA，且DNA的浓度相对较高。

2.2 环境DNA PCR扩增结果

经滤膜法和沉淀法处理后的环境水样，在相同的eDNA提取步骤后，细菌16S rDNA的扩增结果有明显的不同。小型水池采用滤膜法和大型水塘采用沉淀法处理的水样其3个试验组在PCR扩增后均可见明显的目的条带；小型水池采用沉淀法处理后仅在40 mL水样组中有目的条带出现，且其扩增结果并不稳定（2/3样本可见目的扩增条带）；大型水塘采用滤膜法处理的水样，其3个试验组均没有出现目的条带。此外4个空白对照组和4个PCR阴性对照均没有出现目的条带，4个阳性对照有明显的目的条带（图2）。

3 结论与讨论

在当前，环境DNA因其具有采样容易、分析简单、试验操作方便等特点而在保护生物学、生物多样性和入侵生物学的研究中得到广泛的应用。该研究通过应用滤膜法和沉淀法对大型水塘和小型水池的环境DNA提取方法进行了探讨，并据此建立了完整的eDNA提取方案。

研究中对环境DNA的直接电泳检测发现大型水塘内的eDNA含量高于小型水池。不同水体中由于生活的生物体不同，其水样中的eDNA含量也有所差异[15]。该研究的大型水塘内由于生活着鱼类、鸟类、植物等多种生物体，因而其水样中的eDNA含量相对小型水池的水样较高。此外，进一步用细菌16S rDNA通用引物来检测eDNA的质量，结果发现在大型水塘中用滤膜法所提取到的浓度较高的eDNA在细菌的检测中未能有扩增结果，而采用沉淀法获得的eDNA在細菌PCR中可获得较好的扩增条带。环境DNA是一种混合DNA，也是各种生物体留在水样中的DNA，在进行环境DNA提取过程中，可能会残留PCR抑制物，因此在用eDNA进行PCR扩增时很可能会出现PCR抑制[16]。由于滤膜法所获得的eDNA浓度要高于沉淀法，这可能导致滤膜法获得的eDNA由于存在更多抑制因子而造成扩增失败。在对小型水池的eDNA细菌PCR检测发现，小型水池的水样在滤膜法和沉淀法处理后不能直接通过电泳检测到eDNA的含量，但经滤膜法提取的eDNA在细菌PCR中检测到了扩增产物。这个结果的出现可能是由于小型水池中的环境DNA本来就很少，浓度很低，而滤膜法相对沉淀法能够更好的富集eDNA。

此外，在环境DNA的研究中，在环境水样采集后对水样的保存也是影响eDNA产量和质量的一个重要因素。该研究由于采样点与实验室距离较近，所以并未对采集的水样进行前处理。但如果采样点与实验室距离较远，可通过在水样中添加缓冲液，如每15 mL水样中加入1.5 mL 3 mol/L的醋酸钠和33 mL无水乙醇等方法对水样进行保存。在滤膜法中滤膜的选择上也有很多种，如醋酸纤维滤膜、混合纤维滤膜、尼龙膜、玻璃纤维滤膜等，但已有研究表明，不同的滤膜具有不同的DNA回收率，其中混合纤维滤膜的回收效果最佳[17]。

该研究采用滤膜法和沉淀法对大型水塘和小型水池的eDNA进行了研究，结果发现2种方法均可以提取到eDNA。但就试验结果来看，滤膜法相对于沉淀法可获得浓度更高的eDNA，因此建议在生物量较高的水体中采用沉淀法来处理水样，而在生物量较低的水体中则推荐使用滤膜法。

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