ABCA1基因-565C/T基因变异与冠状动脉狭窄程度的关系

至今已发现90多个与疾病相关的三磷酸腺苷(ATP)结合盒转运蛋白A1(ATP-binding cassette transporter 1， ABCA1)基因变异位点，这些单核苷酸多态性变异位点分布在编码区和非编码区(包括启动子区也就是基因调控区)，位于基因调控区(启动子)序列中的单核苷酸多态性则会影响基因表达量，对人体有重大影响，也是目前基因组研究的一个热点。因此本课题重点研究基因调控区(启动子区)-565C/T基因单核苷酸多态性在内蒙古地区人群中的分布和差异，分析其与冠心病易感性及与血脂的关系，并通过冠状动脉造影检查探讨-565C/T基因多态性与冠状动脉病变严重程度的关系，通过确定ABCA1多基因核苷酸序列多变异差异与表型、疾病风险和冠状动脉病变严重程度之间的关系，解释内蒙古地区个体对冠心病遗传易感性和疾病严重程度的差异，分析对药物耐受性和不同环境因素的反应差异。

1 资料与方法

1.1 临床资料 冠心病组为2009年1月—2015年12月在我院心内科行冠状动脉造影阳性(至少1支冠状动脉狭窄≥50%)病人141例，对照组204例为经冠状动脉造影排除冠心病者。排除标准：严重肝肾功能不全、血液病、结核、肿瘤、大动脉炎等疾病。通过问卷访谈收集研究对象的基础资料、既往史、家族史、吸烟史等。吸烟史的标准为过去1年或1年以上每天吸烟10支以上。所有研究对象均未服用调脂相关药物。

冠状动脉三支动脉为左前降支、左回旋支和右冠状动脉，根据动脉粥样硬化受累支数分为单支、双支和多支病变，其中左主干受累定义为双支病变，双支以上病变为多支病变。本研究分为单支病变组、双支病变组和多支病变组。根据美国心脏学院/美国心脏病学会(ACC/AHA)的PTCA指南按照冠状动脉病变特征分为A型病变、B型病变和C型病变3种。A型病变指冠状动脉病变范围为孤立性短病变(长度<10 mm)、无或轻度钙化、同心性、非完全闭塞、容易到达、非开口部、管壁光滑、未累积大分支、无血栓、非成角病变(<45°)；B型病变指冠状动脉病变为管状狭窄(10～20 mm)、中重度钙化、偏心性、完全闭塞(<3个月)、近端血管中度弯曲、开口部病变、管壁不光滑、需要导丝保护的分叉病变、冠状动脉内血栓、成角病变(>45°，<90°)；C型病变指冠状动脉病变为弥漫性(长度>20 mm)、不能保护的大分支、近端血管弯曲、易碎的脆性退化静脉桥病变、完全闭塞(>3个月)、重度成角病变(>90°)。

1．2 方法

1.2.1 血脂水平的检测 所有化验检查均采用次日清晨空腹采集静脉血3 mL，分离血清测定血脂水平，三酰甘油(TG)、胆固醇(TC)以氧化酶法测定，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)用PEG变构酶法测定，试剂均为Leadman公司生产。仪器为日本OLYMPUS AU 600全自动生化分析仪。

1.2.2 DNA提取 用EDTA抗凝真空采血管采集外周静脉血3 mL，置于-80 ℃保存备用。按照血液-细胞-组织基因组DNA提取试剂盒的说明提取血液DNA。

1.2.3 设计PCR引物 -565C/T基因的上下游引物分别是5′GGCTTTGACCGATAGTAACCT 3′和5′CTCTTTCTCCTACCCCTTGAC 3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司提供。

1.2.4 ABCA1基因多态片段的PCR扩增 PCR反应在PTC-200型循环仪中进行。PCR 反应体系50 μL，包括：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，DNA 2.0 μL，上游和下游引物分别为1.0 μL，灭菌超纯水21 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，53～58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环；72 ℃终末延伸5 min。

1.2.5 PCR产物的酶切消化 取PCR产物4 μL，分别加入内切酶AciI 1 μL和10×Buffer 2 μL，加入灭菌超纯水14 μL，37 ℃水浴酶切16 h。取酶切产物在2%琼脂糖凝胶中电泳检测并确定样品基因型，DNA Marker为BioMarkerⅠ。内切酶AciI、BsmA I和10×buffer由美国BioLabs公司提供。

2 结 果

2.1 冠心病组和对照组基线资料比较 对冠心病组和对照组的基因型分布进行平衡检验，χ2检验表明ABCA1基因-565C/T各4种基因型的分布符合Hardy-Weinberg平衡遗传定律，具有群体代表性。详见表1。

表1 冠心病组和对照组基线资料比较(±s)

与对照组比较，1)P<0.05

2.2 -565C/T各基因型和等位基因分布频率及血脂比较 冠心病组-565C/T各基因型及其等位基因与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。冠心病组-565C/T CC、TC、TT 3种基因型HDL-C、LDL-C、TG、TC比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

表2 冠心病组和对照组-565C/T位点各基因型及等位基因频率分布比较 例(%)

表3 冠心病组-565C/T 3种基因与血脂指标比较(±s) mmol/L

2.3 冠心病组-565C/T基因多态性各基因型与冠状动脉病变支数的关系 -565C/T基因的双支病变组、多支病变组各基因型及其等位基因与单支病变组比较差异有统计学意义(P<0.05)，说明-565C/T这两个基因的TT基因型和T等位基因与冠状动脉病变范围有关，TT基因型和T等位基因增加冠状动脉病变范围。详见表4。

表4 冠心病组-565C/T基因型与冠状动脉病变支数的关系 例(%)

2.4 冠心病组-565C/T基因多态性各基因型与冠状动脉病变程度的关系 -565C/T B型病变组、C型病变组各基因型及其等位基因与A型病变组比较差异有统计学意义(P<0.05)，说明-565C/T这两个基因的TT基因型和T等位基因与冠状动脉病变严重程度相关，可以增加冠状动脉的病变程度。详见表5。

2.5 -565C/T基因酶切电泳图(见图1) TT型等位基因的351bp扩增产物有278bp、73bp两个片段，而CC基因型可被切成148bp、130bp、73bp 3个片段，TC基因可被切成278bp、148bp、130bp、73bp 4个片段。

图1 -565C/T酶切产物及Marker电泳图

3 讨 论

ABCA1的功能是介导细胞内过量胆固醇外流到载脂蛋白，并将其包装成HDL-C，ABCA1是调节血浆HDL-C及细胞内胆固醇水平的重要载体，对控制动脉粥样硬化的形成起着举足轻重的作用。如果ABCA1基因突变，胆固醇从巨噬细胞内流出至细胞外的过程发生障碍，使胆固醇和磷脂流出减少，进而使载脂蛋白A1不能与之有效结合，很快经肾脏清除，由此HDL-C合成障碍，会引起大量胆固醇和胆固醇脂在巨噬细胞内积聚而成为泡沫细胞，继而浸润血管壁，促进动脉粥样硬化和冠心病的发生发展。ABCA1基因不同位点的变异与动脉粥样硬化的发生、发展及血脂密切相关，有一些变异使HDL-C水平增高[1-2]，具有抗动脉粥样硬化和减少冠心病危险性的作用[3-6]，如：R219K。有些变异使HDL-C水平下降，如R230C、R1587K、V8251[7]，在启动子区的单核苷酸多态性增加冠心病的危险性，如：C69T[8-9]。有些变异可能没有或很少影响到ABCA1的功能，与血浆HDL-C水平变化无明显相关性，如-14bp和ZNF位点[10]。

ABCA1基因位于染色体9q31，其启动子区的-565C/T位点基因多态性 r82422493是胸腺嘧啶取代胞嘧啶。关于冠心病与-565C/T基因多态性的相关研究，国内外有不同的研究结论报道。Babashamsi等[11]报道-565C/T T等位基因增加α低脂蛋白血症风险，并且降低HDL-C，升高TG、IL-6和C反应蛋白。Ruiz等[12]报道-565C/T T等位基因增加亚临床型心血管疾病的危险性，并且与冠状动脉粥样硬化的严重程度相关。Rejeb等[13]的报道与Ruiz等[12]不一致，Rejeb等[13]研究结果表明突尼斯人-565C/T变异与冠心病无相关性，说明-565C/T不是冠心病的易感基因，这与本研究结果基本一致，即ABCA1基因-565C/T等位基因变异在冠心病和对照组之间的分布频率差异无统计学意义，与冠心病的发病亦无显著相关性，但-565C/T TT基因型和T等位基因与冠状动脉病变支数和冠状动脉病变程度相关，也就是说-565C/T TT基因型和T等位基因虽然不是冠心病的易感基因但增加冠状动脉病变范围和加重冠状动脉病变程度，Qi 等[14]研究表明这种增加冠状动脉病变严重程度的原因与TT基因型ABCA1的蛋白表达以及胆固醇外流功能减低有关，推测TT基因型通过影响ABCA1蛋白表达进而影响巨噬细胞胆固醇外流功能，促进冠状动脉病变范围和严重程度进一步发生发展，它是不依赖于影响中间表型如HDL-C、 LDL-C、TG等变化的。

本研究虽然未能发现-565C/T基因多态性与冠心病及HDL-C等有关联性，但发现TT基因型和T等位基因虽然不是冠心病的易感基因但增加冠状动脉病变范围和加重冠状动脉病变程度，这对于将来开发和寻找有关ABCA1基因表达具有特异性调控作用的药物奠定了一定的基础，对预防和治疗高脂血症、动脉粥样硬化、冠心病等都具有十分重要的意义。由于在胆固醇逆转运及防治心血管疾病方面的重要作用，近几年ABCA1引起了人们的广泛兴趣，其表达调控成为研究的热门领域。随着对ABCA1基因认识的深入，针对ABCA1介导的逆转运及基因多态性的研究将有助于探讨人类重大疾病冠心病的发病机制以及其与冠状动脉严重程度的关系，将为ABCA1的基因诊断及基因治疗的开展提供重要的依据。