膀胱穿刺活检术在膀胱出口部分梗阻大鼠中应用的可行性

刘 迅，陈 林，何平林，王 凯，刘俊莹，陈书练，杨 进，罗 旭

(1.遵义医科大学，贵州遵义 563000；2.成都大学附属医院泌尿外科，四川成都 610081；3.成都大学附属医院中心实验室，四川成都 610081)

穿刺活检术是临床上诊断肿瘤或某些癌前病变最重要、最准确的方法之一，是国际公认的诊断金标准，但膀胱肿瘤的诊断目前临床仍采取传统的影像学或经尿道膀胱肿瘤切除术(transurethral bladder tumor resection，TUR-BT)等方法。然而影像学检查并非完全可靠，只能作为初步筛查方法。TUR-BT既为重要诊断方法，也为主要治疗手段，但肿瘤的病理分级及分期都需要借助首次TUR-BT后的病理检查获得，大部分患者往往需要进行二次手术，增加肿瘤分期提前以及残留癌的风险[1]，且该方法创伤较大,有时取不到膀胱肌层，无法准确判断肿瘤分期，影响进一步治疗决策。另一方面，在探究膀胱功能障碍的病理生理过程中，动物模型的使用是必不可少的[2]。传统取膀胱活检的方法主要是通过解剖刀在膀胱壁的一侧切下一块组织，然后再将膀胱对合逐层缝合[3]。该操作不仅过程繁琐，且创伤性较大，所需愈合时间长，不利于对实验动物的进一步操作。如若可将膀胱穿刺术应用于动物实验，即可避免手术操作给实验动物带来较大创伤，又可得到相同的实验结果，这将为膀胱研究的动物实验提供新型的膀胱组织提取方法，具有一定的应用价值。

研究发现，双孔钾离子通道(TWIK related K+channel 1，TERK-1)是正常人膀胱逼尿肌中调节机械牵拉刺激的主要离子通道之一，其为双孔结构的机械门控钾通道(two-pore-domain mechano-gated potassium channel，K2P)亚家族中的主要表达成员[4]。且研究已经证实，当膀胱逼尿肌进行性充盈时TERK-1具有稳定膜电位的作用，从而降低膀胱兴奋性和防止发生收缩排尿[5]。先前有学者观察到，TERK-1在膀胱出口梗阻小鼠的逼尿肌中表达下调[6]。本实验创新性地将膀胱穿刺活检术应用于膀胱出口部分梗阻大鼠，通过观察不同梗阻时间膀胱逼尿肌的形态学变化及膀胱组织中TERK-1通道的表达情况，评价并讨论膀胱穿刺活检术在临床及动物实验中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 动物该实验经成都大学附属医院动物研究伦理委员会批准。将18只Sprague-Dawley雌性大鼠(体重250～280 g，8～12周龄，中国成都，达硕实验动物有限公司)采用完全随机设计，分为对照组(n=6)、梗阻14 d组(n=6)和梗阻28 d组(n=6)。所有实验动物均在标准条件下饲养，保持在光控(12 h光照/黑暗循环)笼中，每个笼子有3只大鼠，可自由摄取食物和水。

1.2 建立膀胱出口部分梗阻模型本实验采用CHEN等[7]的新型膀胱出口部分梗阻模型建立方法,即尿道外口梗阻法进行实验大鼠模型的建立，为保证动物模型的一致性，所有手术均由同一位经验丰富的外科医生操作。具体操作为，吸入异氟烷麻醉大鼠,消毒下腹部及尿道外口，将小儿静脉留置导管(G 26，内径=0.4 mm，外径=0.6 mm，16 mm)经尿道插入大鼠膀胱，将不可吸收的6-0带线缝合针(杭州艾普医疗器械有限公司，杭州，中国)在12点钟位置纵向穿过尿道口，在尿道口的6点钟方向穿出并打结。缝线结形成后移除导管，以产生下尿路梗阻症状。

1.3 膀胱穿刺常规麻醉、消毒后，取下腹部正中切口，长约1.5～2 cm，逐层切开皮肤及皮下组织，钝性分离腹壁肌肉，打开腹膜，将充盈膀胱轻轻提起，采用临床上使用的全自动型活检针(G 18，长150 mm，针突长22 mm)垂直穿过膀胱前后壁，激发活检枪后抽出。取标本时应尽量取到膀胱壁全层，将标本浸泡于4%多聚甲醛溶液质量体积分数中固定。固定1 d后用石蜡包埋，将包埋好的组织切成薄切片(5 mm)，舒展开置于载玻片上，放入45 ℃的恒温箱中烘干。

1.4 HE染色将切片置于二甲苯中脱蜡后，依次放入无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、75%、85%乙醇(体积分数)中水化，苏木素染色5 min，盐酸水溶液分化，氨水水溶液返蓝，水洗，入伊红染液中染色5 min。由低到高逐级梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.5 免疫组织化学染色采用标准免疫组化技术流程操作，将石蜡切片脱蜡水化，步骤同1.4，将切片浸在柠檬酸抗原修复缓冲液(pH 6.0)中，置于微波炉内煮沸20 min进行抗原修复，冷却至室温后，滴加3%(体积分数)双氧水溶液阻断内源性过氧化物酶，室温孵育25 min，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)冲洗。将配好的5%(质量体积分数)牛血清白蛋白溶液(albumin from bovine serum，BSA)覆盖组织，封闭30 min后，滴加1∶100的一抗(K2P2.1，Alomone labs APC-O47)，湿盒内4 ℃孵育过夜。PBS溶液冲洗3次，滴加辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗，室温孵育50 min，再次PBS溶液冲洗3次，滴加现配制的DAB显色液(Dako REALTM EnVisionTM Detection System,Peroxidase/DAB+,Rabbit/Mouse)，显微镜下观察染色程度把握终止显色时间。苏木素复染细胞核，1%盐酸乙醇(体积分数)分化，流水冲洗，由低到高逐级梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。将封好的玻片放在200倍光镜下观察，细胞质内出现棕黄色或棕褐色颗粒为TERK-1通道蛋白表达阳性细胞，我们根据着色强度通过图像分析软件(Image Pro Plus 6.0)对TERK-1通道表达情况进行分析统计。

1.6 统计学方法应用SPSS 22软件包进行统计学分析，运用独立样本t检验进行分析，定义P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HE染色200倍光学显微镜下可观察到对照组大鼠膀胱平滑肌细胞体积适中、排列紧凑、肌纤维分布均匀，但在标本中未能观察到膀胱上皮结构；与对照组相比，14 d梗阻组和28 d梗阻组的大鼠膀胱肌纤维束排列紊乱、形态不规则，肌间隙明显增宽，肌细胞肥大，膀胱平滑肌横截面明显增厚(图1A～C)。

2.2 大鼠膀胱壁中TERK-1通道分布及表达情况结果表明，SD大鼠膀胱中TERK-1通道的表达随着梗阻时间的延长呈逐渐下降趋势，梗阻28 d的大鼠比对照组大鼠表达明显减少，差异具有统计学意义(t=3.122，P=0.035，图1D～G)。

图1 采用膀胱穿刺活检技术获得的正常和梗阻膀胱组织观察

A：对照组(HE，×200)；B：梗阻14 d组(HE，×200)；C：梗阻28 d组(HE，×200)；D：对照组(TERK-1，×200)；E：梗阻14 d组(TERK-1，×200)；F：梗阻28 d组(TERK-1，×200)；图B、C中箭头所指为膀胱平滑肌病理性肥厚扩张；图D、E、F中细胞质内出现棕黄色或棕褐色颗粒为TERK-1通道蛋白表达阳性细胞；G：免疫组化TERK-1蛋白阳性表达统计图。

3 讨 论

膀胱的急性充盈期同时受到神经源性和肌源性的共同调节，该机制可降低膀胱内压力以适应进行性尿量增加导致的膀胱容积的急剧扩增。在长期的膀胱出口梗阻中，持续的膀胱高压可引起膀胱壁的慢性缺血缺氧和去神经化作用，从而导致膀胱功能障碍[8-10]。但急性的膀胱出口梗阻由于传入膀胱神经冲动的增加，可导致膀胱逼尿肌的过度活动，是导致膀胱平滑肌的代偿性肥大的机制之一[11]。已经证明，在膀胱出口梗阻4周时，即可出现膀胱逼尿肌的明显增厚与肥大[12]，该结论与本研究结果一致(图1C)。

此外，肌源性学说在调节膀胱兴奋性的机制中发挥着重要作用[13]。目前，研究者已经证实了几种类型的机械敏感K+通道的作用[14]。为了进一步证实穿刺标本的可应用性，我们选择了目前研究相对成熟的TERK-1机械门控钾离子通道，该通道蛋白广泛分布于膀胱尿路上皮和平滑肌层组织中，阳性表达率高，便于观察染色结果[15]。研究发现，在膀胱平滑肌充盈、拉伸过程中，TERK-1发挥了稳定逼尿肌膜电位的重要作用，其表达的减少可能是导致膀胱逼尿肌过度活动的一个重要因素。通过对穿刺膀胱标本进行TERK-1抗体的免疫组化染色，我们发现该通道蛋白随着梗阻时间的延长呈明显下降趋势(图1D～G)，与已知结论相吻合，进一步证明了穿刺组织标本的实际应用价值。

本研究中，我们针对实验动物膀胱穿刺活检技术的应用价值进行了探讨，证明利用穿刺针取出的膀胱组织标本足以用于HE染色及免疫组化等病理学分析研究。经化学染色后，在光镜下可清楚观察到膀胱肌层形态及排列方式，与传统方法取出的组织标本相比，镜下形态差异并不显著。经查阅相关文献了解到，这是首次将膀胱穿刺活检技术应用于大鼠，不仅以微创的方法成功提取了膀胱组织，保留了膀胱结构的完整性，降低了腹腔感染及膀胱与腹壁粘连的几率，更重要的是该标本可清楚观察到梗阻大鼠膀胱逼尿肌的形态学变化，具有一定的应用价值。但该方法也存在一定的局限性，从HE染色标本中，我们未能观察到膀胱内整齐排列的移行上皮细胞，可能是由于穿刺过程中穿刺针破坏了上皮结构。其次，由于穿刺的组织体积较小，可提取的蛋白量可能较少，因此，不适宜利用蛋白印迹法对目标蛋白进行半定量分析。

所有的动物实验都是为临床应用做准备，经查阅文献，国内外已有学者探索了临床上影像学辅助下的膀胱穿刺活检技术对于肌层浸润性膀胱癌病理诊断的实际意义。早在1991年，HOSHI等[16]日本学者报道了关于超声引导下的经皮膀胱全层穿刺活检技术，初步探索了肌层浸润性膀胱癌患者在放疗或化疗等新辅助治疗过程中对肿瘤分期的判断及治疗效果的评价。随后，MALMSTROM等[17]进一步探究了经计算机断层扫描(computer tomography，CT)引导的经皮膀胱穿刺活检技术，再次证实穿刺技术可以收集足够的有价值的病理学材料。近几年，国内也有学者证实了超声引导下的膀胱穿刺活检技术对肿瘤性质的鉴别是一种行之有效的方法[18]。虽然穿刺活检技术与传统的TUR-BT相比，具有安全、高效、操作简单、创伤小等优点，但CHLOSTA等[19]也提出应用该方法判断膀胱原位癌或浅表性肿瘤具有一定的缺陷。由于相关临床研究较少，关于膀胱穿刺是否会导致肿瘤的种植转移，目前还没有明确定论，但有学者认为，因穿刺而导致的播散几率不应大于大范围的TUR-BT[20]。虽然目前尚未发现其他相关并发症，但毕竟临床样本量有限，对于该方法是否可以完全取代TUR-BT，还需进一步的探究。

综上所述，膀胱穿刺术以微创的方法成功收集了组织标本用于形态学及病理学检测，可保留膀胱结构完整，降低腹腔感染及膀胱与腹壁粘连的几率，使得实验动物有可能重复利用，是可行的操作方法。