养殖池塘底泥预处理方法对BiologEco板分析结果的影响

周可 谢凤行 张峰峰 孙海波 赵玉洁 赵琼

摘    要：為探讨不同预处理方法对养殖池塘底泥Biolog Eco板分析结果的影响，以南美白对虾养殖池塘周边底泥1#和中部底泥2#为研究对象，考察了文献中常用的5种预处理方法底泥微生物群落平均颜色变化率（ Average well color development，AWCD）、碳源利用模式和多样性指数的差异。结果表明，培养3 d后周边底泥1#样品异养细菌总数（7.73×105 CFU·mL-1）显著低于中部底泥2#样品（3.48×107 CFU·mL-1）（P<0.05）。不同预处理方式底泥微生物群落的AWCD值、六类碳源利用情况、多样性指数及主成分分析差异较大。240 h时，1#底泥方法4和方法5除对胺类碳源的利用（方法5显著高于方法4）外，微生物群落的上述其他指标差异均不显著（P>0.05），但有多项指标显著优于方法1、2、3（P<0.05）;2#底泥方法5处理微生物群落的多项指标显著优于方法1～4;且无论在1#底泥还是2#底泥，方法5主成分分析的平行点均较为集中，说明其平行性较好。因此建议采用方法5进行养殖池塘底泥的预处理，即10%底泥稀释液在250 r·min-1转速下振荡30 min，经600 r·min-1离心10 min，离心上清液直接接入Biolog Eco板。

关键词：养殖池塘;底泥微生物群落;Biolog Eco微平板;底泥预处理方式

中图分类号：S967.4; Q93            文献标识码：A         DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.08.003

Abstract： In order to explore the effects of sediment pretreatment methods on the results of Biolog EcoPlate analysis in aquaculture ponds， the sediments around and in the middle of the ponds of Penaeus vannamel were taken as research objects. The differences of average well color development （AWCD）， utilization of six grouped carbon source， diversity indices and the principal component analysis of sediment microbial communities were examined under five pretreatment methods commonly used in literature. The results showed that the total number of cultivable bacteria in 1# sediment （7.73×105 CFU·mL-1） were significant less than in 2# sediment（3.48×107 CFU·mL-1）after 3 day of incubation（P<0.05）. And there were large differences in AWCD values， utilization of six grouped carbon sources， diversity indices and principal component analysis of sediment microbial communities under different pretreatment methods. At 240 h of incubation， there was no significant differences in above indexes of 1# sediment between methods 4 and 5 except for the utilization of amine carbon sources （method 5 was significant higher than method 4）， but many indexes in the two methods  were significant superior to method 1， 2 and 3 （P<0.05）; multiple indexes of 2# sediment treated by method 5 were significantly higher than those of method 1， 2， 3 and 4（P<0.05）; the parallel points of method 5 in PCA plots were aggregated indicating that the data was stable no matter in 1# sediment or 2# sediment. The results suggested that method 5 was the optimal method for pretreating aquaculture pond sediment， and the method was as follows： 10 g of sediment were transferred to a conical flask containing 90 mL 0.85% sterilized saline， shaking for 30 minutes at 250 r·min-1， the suspension was centrifuged for 10 minutes at 600 r·min-1， and the centrifugal supernatant was directly inoculated into the Biolog EcoPlates.

Key words： aquaculture pond; microbial community in sediment; Biolog Eco   Plates; preprocessing methods of sediment

目前探究微生物多样性的方法种类较多，Biolog方法是以研究代谢功能多样性与活性为主的一种方法，是由美国BIOLOG公司于1989年发展起来的。Biolog方法的原理是通过微生物对多种碳底物的不同利用类型来反映微生物群落的功能多样性[1]。Biolog方法可以直接反映微生物种群的总体活性，在表征细菌群落动态变化的时空尺度上有显著的优势[2-3]，且具有数据量大、方便、快捷等優点，近年来被广泛应用于土壤、水体和环境等领域[4-9]。

土壤中菌体浓度较高，利用Biolog Eco板开展微生物群落研究时，一般先制备土壤悬浮液再稀释1 000倍或10 000倍[10-11]，以避免土壤颗粒对显色反应的干扰，同时最小化土壤样品中化合物带来的可能影响[12]。Biolog Eco微平板法研究中采用的土壤预处理方法有多种，主要通过振荡、静置、稀释或离心等方式制备菌悬液接入Biolog Eco板[13]。

池塘底泥是池塘底部土壤、沉积物或淤泥的统称，是池塘生态系统的重要组成部分[14]。不同池塘的土壤性质不同，同一口池塘不同位置的土壤组成也有所不同。一般而言，池塘中间底泥比靠近岸边底泥质地更细，有机质含量相对较高[15]。目前尚少见池塘底泥的预处理方法对Biolog Eco板分析结果的影响研究。因此，本项目采用了5种常用的土壤和底泥预处理方法，对比不同预处理方法对池塘周边底泥和中部底泥微生物群落功能多样性的影响，以确定底泥预处理的合理方法，为开展底泥微生物群落研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 养殖池塘的选择及养殖管理

底泥取自天津市西青区津静公路北侧1处鱼虾混养池塘，东经117°05'，北纬39°10'，池塘面积为4 hm2，2017年5月20日每公顷放虾苗30万尾，鲤鱼苗4 500尾，鲢鱼3 000尾，鲫鱼6 000尾，草鱼300尾，养殖期间投喂鱼饲料。

1.2 样品采集

2017年6月12日用柱状采泥器在池塘四周和中心分别采集泥样，周边和中部底泥分别命名为1#样、2#样。取样时，用无菌药匙剥去约0.5 cm表层泥，收集5 cm以上的底泥，每种底泥分别在3个位置取样后混合，装入无菌取样瓶，低温保存带回实验室开展Biolog Eco微平板试验。泥样的理化指标如表1所示。

1.3 测定方法

1.3.1 总异养细菌总数的测定    将所取底泥利用0.85%灭菌生理盐水进行梯度稀释，取合适稀释度的0.1 mL稀释液涂布营养琼脂平板，28 ℃倒置培养3 d计算菌落总数。

1.3.2 底泥的预处理方法    底泥的预处理方法包括以下5种。

（1）准确称取相当于10 g干泥的新鲜底泥，加入装有无菌生理盐水的三角瓶中（带玻璃珠）制成10%底泥稀释液，200 r·min-1振荡30 min，静置10 min后取上清液稀释到10-3[16];

（2）准确称取相当于10 g干泥的新鲜底泥，加入装有无菌生理盐水的三角瓶中（带玻璃珠）制成10%底泥稀释液，250 r·min-1振荡30 min，静置10 min后取上清液稀释到10-3[10];

（3）准确称取相当于10 g干泥的新鲜底泥，加入装有无菌生理盐水的三角瓶中（带玻璃珠）制成10%底泥稀释液，250 r·min-1振荡30 min，取30 mL底泥悬浮液于50 mL离心管中，以600 r·min-1离心10 min，离心液稀释到10-2;

（4）准确称取相当于10 g干泥的新鲜底泥，加入装有无菌生理盐水的三角瓶中（带玻璃珠）制成10%底泥稀释液，250 r·min-1振荡30 min，不静置，底泥悬浮液直接稀释到10-3;

（5）准确称取相当于10 g干泥的新鲜底泥，加入装有无菌生理盐水的三角瓶中（带玻璃珠）制成10%底泥稀释液，250 r·min-1振荡30 min，取30 mL底泥悬浮液于50 mL离心管中，以600 r·min-1离心10 min，离心液直接接入平板[17-18]。

1.3.3 Biolog Eco微平板操作    用八道移液器将底泥预处理样液加入预热的Biolog Eco板中，每孔加150 μL，将加好样的Biolog Eco板加盖放入保鲜盒中，25 ℃培养，每隔24 h利用酶标仪（Biotek Elx808）读取各孔在750 nm和590 nm 波长下的吸光度数值。

1.4 数据处理和分析

1.4.1 池塘底泥微生物群落平均活性    Biolog Eco板具有96个孔31种碳源，每种碳源设3个重复。采用OD590-OD750的值表示微生物代谢活性，OD590和OD750的值为分别减去相应对照孔的吸光值，当上述差值为负或小于0.06时修正为0[19]。

2 结果与分析

2.1 底泥不同预处理方式的AWCD曲线

培养3 d后1#和2#号样品的异养细菌总数（表1）分别为7.73×105 CFU·mL-1和3.48×107 CFU·mL-1，2#样品显著高于1#（P<0.05）。从图1可知，1#样5种方法AWCD值曲线的整体趋势相同，AWCD曲线在经过一定延迟后迅速升高，进入指数增长，然后随着时间的延长趋于稳定，达到稳定的时间点分别为192，192，192，168，144 h，在240 h时方法2、方法4和方法5的AWCD值没有显著差异（P>0.05），但显著高于方法3和方法1（P<0.05）;2#样5种方法AWCD值曲线差异较大，达到稳定的时间点分别为96，96，192，168，144 h，方法1和2的AWCD值在240 h内未出现指数增长，方法3、4、5的AWCD曲线数值差别较大，240 h时方法5的AWCD值显著高于其它方法（P<0.05）。

2.2 六类碳源利用情况

以240 h的数据对比5种方法的碳源利用，结果如图2所示。除对碳水化合物、胺类碳源的利用以外，方法2、3、4、5处理的1#泥样微生物群落对各类碳源的利用没有显著差异（P>0.05）;2#泥样采用方法5处理的微生物群落对碳化合物类和胺类碳源的利用显著高于方法4（P<0.05），而其它类碳源的利用二者没有显著差异（P>0.05），但各类碳源的利用都高于方法1、2、3。

2.3 多样性指数的变化

由表2可知，1#、2#泥样方法4和方法5处理下微生物群落的各项多样性指数均没有显著差异（P>0.05），但都高于其他3种方法。1#泥样方法2的Pielou均勻度、Simpson指数和McIntosh均匀度与方法4和方法5差异不显著（P>0.05）。2#泥样的Pielou均匀度和McIntosh指数在各处理方法下没有显著差异（P>0.05），Simpson指数在方法3、4和方法5之间没有显著差异（P>0.05），除方法1外McIntosh 均匀度在各方法之间没有显著差异（P>0.05）。

2.4 主成分分析

选用240 h吸光值数据对1#和2#底泥不同处理方式进行主成分分析，结果如图3和表4所示。1#底泥第一主成分的贡献率为17.00%，第二主成分的贡献率为10.19%，方法1、2、3各平行点分散分布，方法4和方法5平行点聚集紧密。对主成分分析所得的第一主成分得分和第二主成分得分进行方差分析，结果发现：1#样第一主成分得分在方法2和方法3没有显著差异（P>0.05），方法4和方法5没有显著差异（P>0.05）;2#样第一主成分的贡献率为24.12%，第二主成分的贡献率为7.82%，方法1和方法2聚集分布在第一主成分负向，方法4和方法5分布在第一主成分正向;方法3各平行点分布较分散，说明方法3数据平行性较差。对主成分分析所得的第一主成分得分和第二主成分得分进行方差分析，结果发现：第一主成分得分方法3、4和5之间存在显著差异（P<0.05），而方法1和方法2没有显著差异（P>0.05）。

3 结论与讨论

在开展土壤微生物群落研究时，一般需要通过震荡、离心或超声处理等方式破坏土壤颗粒和微生物之间的氢键、范德华力及静电作用制成菌悬液，在最大程度释放微生物的同时保证微生物的活性[13]。本研究以鱼虾混养池塘底泥为研究对象，探讨了底泥预处理方式对Biolog Eco板分析结果的影响。1#底泥5种方法处理底泥微生物群落达到的最大AWCD值分别为0.752 4，0.931 6，0.847 1，0.973 6和

0.954 8，其中方法1、3与方法2、4、5之间存在显著差异（P<0.05）。2#底泥5种方法底泥微生物群落达到的最大AWCD值分别为0.056 1，0.135 3，0.488 9，

0.926 4和1.146 9，方法5的AWCD值显著高于其它方法（P<0.05）。AWCD作为平均颜色变化率反映的是Biolog Eco板的平均活性，其值不同说明不同处理方法底泥微生物群落的平均活性差别较大，因此选择适宜的底泥预处理方法对结果分析相当重要。

本研究发现除对胺类碳源的利用外，1#底泥微生物群落的AWCD值、六类碳源的利用、多样性指数及主成分分析在方法4和方法5之间没有显著差异，但多项指标都显著高于方法1、2和方法3（P<0.05）。2#底泥除方法4和方法5之间的多样性指数没有显著差异外，方法5处理的微生物群落多项指标都显著高于其他4种方法（P<0.05）。分析1#和2#底泥不同预处理方法后微生物群落存在显著差异的原因与底泥性质差异有关。1#底泥取自池塘四周，土壤中的粘土含量较高[14]，振荡后不容易沉降，因此除对碳水化合物类碳源的利用及主成分分析外，1#底泥微生物群落的AWCD值、多样性指数在方法4（不静置）和方法2（静置）之间没有显著差异（P>0.05）。2#底泥为池塘中部深水区底泥，由大量投饵的残料、生物排泄物和尸体等长期积累及泥沙沉积形成[23]。2#底泥特别易于沉降，而且底泥因含有腐殖质具有一定的吸附作用[23]，底泥悬浮液静置后悬浮液特别通透，因此采用振荡后静置的方法1和方法2 处理的底泥微生物群落AWCD值未出现指数增长。

虽然1#底泥和2#底泥不同预处理方法下计算的微生物群落的AWCD值、碳源利用模式及多样性指数存在较大差异，但是采用方法5处理的两个底泥微生物群落的各项指标均优于其他方法。方法5对底泥悬浮进行600 r·min-1离心，离心后的上清液直接接入Biolog Eco微平板，推测低速离心通过不同的沉降速度将菌体和底泥分开[13]，避免了底泥颗粒对Biolog Eco微平板显色的影响，同时最大程度地将菌体保存在上清液中，因此建议采用方法5进行池塘底泥的预处理。

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