石韦内生真菌SW-7产黄色素的发酵条件

裴枭鑫，吴迪，李玉芳，袁彦彦，刘俊林*

(1.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730110； 2.西北民族大学 化工学院，甘肃 兰州 730110)

随着人们对食品安全的注重和对健康意识的提高，天然色素越来越受人们的关注和喜爱，其中黄色素约占市场需求量的60%以上。目前，市场上常见的黄色素产品多以植物提取为主(如姜黄素、南瓜黄、栀子黄等)，但易受季节、气候、产地等许多因素的影响[1]。微生物作为正在开发的新兴资源它将拥有很大的研究空间，目前已发现多种菌可产黄色素，如赵靖等[2]发现，红曲霉具有产红曲黄色素的能力。杨柳等[3]发现，粒毛盘菌可产黄色素并研究了其色素的稳定性。左勇等[4]在研究P.agaridevorans红色素时发现，该菌具有产黄色素的能力。今从药用植物石韦叶中分离纯化得到产黄色素真菌，可作为黄色素的新型来源。

真菌广泛存在于自然界，在长期进化中，一些真菌寻找到理想的生活环境——植物体，进入植物体并和谐地与之生活在一起，成为植物体微生态系统的组成部分。它们生活在植物的根、茎、叶等器官的组织内部，但一般不引发植物体病害，这些真菌被称之为内生真菌[5]，内生真菌因其生于植物体内部，故不同于别种真菌，其赋予产特殊产物的能力的几率更大，因此备受关注[6]，目前研究已发现内生真菌具有产抑菌[7]、抗肿瘤[8]、防线虫[9]、抗氧化[10]等功能产物的能力，更是很多天然产物的新来源。

石韦又名石皮、金星草、石兰，味甘苦，性微寒，归肺、膀胱经，能利尿通淋、清肺止咳、凉血止血，用于热淋、血淋、石淋、小便不利、淋沥涩痛、肺热咳嗽、吐血、衄血、尿血、崩漏等症状。石韦中主要含有里白烯、β-谷甾醇、绿原酸、杧果苷、槲皮素、异杧果苷、异槲皮素、蔗糖等多种成分[11]。该真菌是从石韦干叶中分离得到的1株菌，在其生长过程中产生大量的黄色素，且性质相对稳定。天然色素研究受到大家的重视，但对真菌产黄色素的研究少有报道。本试验对产黄色素真菌(SW-7)生长条件进行初步分析，对该真菌深层发酵条件进行优化研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

从石韦内分离得到1株内生真菌。

1.1.2 供试培养基

PDA培养基。200 g土豆切小块煮沸30 min，挤压过滤，滤液中加20 g葡萄糖。

大米培养基。大米粉20 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1 g，NaNO32 g，KH2PO41.5 g，MgSO41 g。

查氏合成培养基。蔗糖30 g，NaNO33 g，MgSO40.5 g，FeSO40.01 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g。

高氏培养基。可溶淀粉20 g，NaCl 0.5 g，KNO31.0 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂20 g。

以上培养基均完全溶解后添加蒸馏水定容至1 000 mL。在121 ℃条件下灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌种制备

将内生真菌(SW-7)接种至平板培养基，28 ℃培养4 d，用灭菌接种环轻刮菌体表面，释放孢子。10 mL孢子液接种至100 mL种子液培养基中，30 ℃、160 r·min-1培养36 h。

1.2.2 黄色素发酵培养基选择

向4种50 mL菌体培养基中分别接入5 mL种子液，在28 ℃、160 r·min-1暗培养发酵，颜色稳定后进行发酵物分离、色素吸光值(D)测定和生物量测定。

1.2.3 深层发酵试验正交设计

在以上试验基础上选择PDA液体培养基为发酵底物，以菌体生物量、黄色素为目的物，设转速(A)、pH值(B)、温度(C)和发酵时间(D)四因素进行正交试验设计。

1～4水平：A分别为140、150、160、170 r·min-1；B分别为5、6、7、8；C分别为26、28、30、32 ℃；D分别为6、8、10、12 d。

1.2.4 发酵产生菌体生物量的测定

将达到发酵终点的发酵液5 000 r·min-1离心10 min后去上清液，沉淀用灭菌水洗涤2遍，在60 ℃烘箱中烘干至恒重，分析天平准确称量得到菌丝体质量，即为发酵产生菌体的生物量[12]。

1.2.5 黄色素发酵原液吸光度的测定

参照文献[13]稍作修改，准确取一定体积发酵原液滤液将达到发酵终点的发酵液5 000 r·min-1离心10 min后取上层液，稀释至一定倍数，并于375 nm所测得的最大吸收峰处测D值。

2 结果与分析

2.1 SW-7在不同培养基中生长状况

如表1所示，SW-7在PDA培养基中菌丝体产量最多，色素产量也最大；SW-7在大米培养基中的生物量和色素量皆仅次于PDA；在查氏培养基中菌株长势虽好，但不适用于黄色素的深层发酵；在高氏培养基中色泽偏黄绿色，影响了色素色泽，故在后期正交试验中使用PDA培养基为基础进行SW-7的发酵条件研究。

表1 SW-7菌株在4种培养基中生长状况

2.2 SW-7菌体在深层发酵的表现

由表2可知，培养温度(F值=15.426*)和发酵时间(F值=20.400*)对SW-7黄色素产量影响亦显著。根据F值大小得出4个因素对SW-7菌体产量影响大小次序为发酵时间、温度、初始pH值(F值=2.101)、转速(F值=1.341)；根据K值得出以真菌菌体产量为目的物的最佳组合为A3B1C3D3，即转速160 r·min-1、初始pH值5、温度30 ℃、发酵时间10 d。在此条件下通过验证实验可得，摇瓶发酵菌体产量为7.68 g·L-1，色于此条件下发酵产色素。本试验目的是提高色素产素吸光度为1.716，表明真菌SW-7最适量，故以A3B1C3D3方案为最终发酵最佳条件。

表2 SW-7深层发酵正交试验直观分析

3 小结

通过对比SW-7在不同培养基中生长状况和产色素能力发现，SW-7较适合于PDA培养基和大米培养基；SW-7在天然培养基中生长较合成培养基更快更好，分泌产物能力更强，在PDA培养基上分泌色素色泽偏深黄，而在大米培养基则为金黄色。选择PDA培养基来深层发酵石韦内生真菌SW-7黄色素，通过正交试验设计的方式综合分析影响本菌分泌色素的因素，从而达到优化该菌发酵产黄色素的发酵方案，得出适合于SW-7产生黄色素物质的基本条件为转速160 r·min-1、pH值5、发酵温度30 ℃、发酵时间10 d。经过二次试验验证，在该条件下，真菌菌体为7.68 g·L-1，色素吸光度为1.716。通过本试验的条件优化，SW-7色素产量明显增大，为SW-7真菌色素的利用提供理论依据。