miR-29c在慢性肾脏病患者血清中的表达及临床意义研究

谢媚媚 潘敏 龚裕强

慢性肾脏病（CKD）是一种病因复杂的的进行性疾病，是导致慢性肾衰竭的主要病因。肾间质纤维化(RIF)是CKD进展到慢性肾衰竭过程中肾脏组织发生的主要病理改变。miRNA是一类约18～24个核苷酸长度的非编码单链小分子RNA，可与靶基因配对引起其降解，或者抑制其翻译，进行转录后调控[1]。笔者团队前期研究发现，miR-29c在大鼠单侧输尿管梗阻模型肾组织中表达下调，可能参与RIF的发生、发展[2]。miRNA在血清中相对稳定，且具有抗酸、抗碱、抗冻融处理、抗RNA酶的特性[3]，血液样本容易获取，这为研究miRNA在血清中的表达提供了可行性。基于此，本研究采用实时荧光定量PCR法检测miR-29c在CKD患者中的表达情况，分析其与RIF的关系，探讨miR-29c作为诊断RIF的生物标志物的可能性，并以期为临床治疗RIF提供新的靶点，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2013年5月至2018年9月本院收治的CKD患者135例为CKD组，其中男71例，女64例；年龄 18～65（40.9±4.8）岁；BMI 18.5～25.8（21.9±2.4）；均符合K/DOQI指南中CKD的诊断标准[4]，其中慢性肾小球肾炎78例，糖尿病肾病25例，高血压肾病24例，多囊肾8例；均经肾穿刺活检明确有不同程度的RIF，所有患者均未开始行透析治疗（包括血液透析和腹膜透析）；排除红斑狼疮性肾炎、紫癜性肾炎、乙肝相关性肾炎等继发性病变以及遗传性肾小球肾炎、肾小管间质病变，排除合并心肺疾病、肾功能突发进行性恶化患者。另择同期健康体检无肾脏疾病者135例为正常对照组，其中男 70 例，女 65 例；年龄 19～64（41.2±5.1）岁；BMI 18.6～26.1（21.7±2.1）；均无糖尿病、高血压等基础疾病。两组受检者性别、年龄、BMI等一般资料比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究经医院医学伦理委员会批准，研究对象知情同意。

1.2 方法

1.2.1 试剂和仪器 Trizol试剂购于美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒、SYBR Green I荧光定量试剂盒购于日本TOYOBO公司；实时荧光定量PCR引物由上海Invitrogen公司设计并提供；低速台式离心机购于上海安亭仪器厂；超低温冰箱购于美国Thermo公司；PCR仪购于德国Eppendorf公司；实时荧光定量PCR仪购于美国ABI公司。

1.2.2 检测方法

1.2.2.1 血清肌酐、胱抑素C水平检测 抽取两组受检者清晨空腹静脉血10ml，室温下静置1～2h，低速离心分离（室温下3 000r/min离心10min），冰上取上清液，部分上清液分装于EP管中，-80℃保存用于提取RNA，另一部分上清液用于检测血清肌酐、胱抑素C。血清胱抑素C检测采用胶乳增强免疫比浊法，试剂盒由金华市强盛生物科技有限公司生产。血清胱抑素C、血肌酐使用西门子ADVIA 2400全自动生化分析仪进行测定。

1.2.2.2 肾脏病理学检查 CKD组患者入院后均首次在B超引导下行经皮肾活检穿刺术，取新鲜肾脏活检标本进行Masson染色，在显微镜下观察肾脏组织病理图片判断RIF的严重程度。RIF指数评估方法：每例标本在光学显微镜下（×200）随机选取10个不重复的肾皮质区进行拍照，采用IPP 6.0图像分析软件计算每个视野小管间质纤维化面积与同视野小管间质总面积的百分比；0分，无损伤，≤5%；1分，轻度损伤，6%～25%；2分，中度损伤，26%～50%；3分，重度损伤，＞50%[5]。10个视野取平均分为RIF指数。

1.2.2.3 miR-29c、胶原Ⅰ（ColⅠ）mRNA水平检测 ColⅠ基因是miR-29c的靶基因之一，ColⅠ是细胞外基质（ECM）的主要组成成份。采用Trizol法提取两组受检者血清总RNA，按照匀浆、两相分离、沉淀、清洗、溶解沉淀步骤进行，提取的RNA置于-80℃超低温冰箱中保存。用紫外分光光度法确定RNA浓度及鉴定纯度。在普通PCR仪进行逆转录反应合成cDNA。反应体系20μl，包括总 RNA 3μg、Oligo（dT）18 2μl、M-MLV 逆转录酶 1μl、RNase inhibitor 1μl、dNTP 1μl、DEPC 水加至20μl。反应条件：16℃ 30min，42℃ 30min，70℃ 15min，结束后反应产物于-20℃保存。使用SYBR Green法，反应体系 20μl，其中前向引物 1.5μl、反向引物 1.5μl、逆转录产物 1μl、plus solution 2μl、SYBR GreenⅠMaster mix 10μl、双蒸水加至 20μl。反应条件为 95℃ 2min，95℃ 15s，60℃ 1min（ColⅠmRNA 为 58 ℃ 1min），进行40个循环反应，所有样品均做3个复孔[2]。应用实时定量 PCR仪进行PCR反应，用2-ΔΔCt法计算相对定量，miR-29c的内参为U6，ColⅠmRNA的内参为GAPDH，ΔΔCt=[Ct目的基因（CKD组）-Ct内参（CKD组）] -[Ct目的基因（正常对照组）-Ct内参（正常对照组）] ，正常对照组的ΔΔCt为0，因此以2-ΔΔCt表示CKD组相对于正常对照组的表达水平。

1.3 观察指标 观察并比较两组受检者血清肌酐、胱抑素C水平及miR-29c、ColⅠmRNA表达水平；分析CKD组患者血清miR-29c表达水平与RIF指数、血清肌酐、血清胱抑素C、ColⅠmRNA之间的关系。

1.4 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件；计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验，相关性分析采用Pearson相关；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受检者血清肌酐、胱抑素C水平及miR-29c、ColⅠmRNA表达水平比较 CKD组患者血清肌酐、胱抑素C水平均高于正常对照组（均P＜0.05），血清miR-29c表达水平低于正常对照组（P＜0.05），ColⅠmRNA表达水平高于正常对照组（P＜0.05），见表1。

2.2 CKD组患者血清miR-29c表达水平与RIF指数、血清肌酐、血清胱抑素C、ColⅠmRNA相关性分析CKD组患者RIF指数为（2.39±0.77）分。CKD组患者血清miR-29c表达水平与RIF指数、血清肌酐水平、血清胱抑素C水平、ColⅠmRNA表达水平均呈负相关（均P＜0.05），见表 2。

表2 CKD组患者血清miR-29c表达水平与RIF指数、血清肌酐、血清胱抑素C、ColⅠmRNA相关性分析

3 讨论

CKD已成为全球公共健康问题，成人CKD全球患病率约为10%～13%[6]。RIF是各种原因导致的CKD进展为终末期肾衰竭的共同途径[7]，因ECM产生与降解失衡，导致ECM在肾间质过度沉积，包括ColⅠ、ColⅢ、ColⅣ和纤连蛋白等。miRNA参与细胞凋亡、增殖、分化及炎症、免疫反应等生理病理过程[8]。miRNA与器官纤维化密切相关，miR-29c在大鼠单侧输尿管梗阻模型肾组织中以及转分化后的大鼠肾间质成纤维细胞中表达下调，可能参与RIF的发生、发展过程[2，9]。本研究CKD组患者均经肾脏穿刺活检明确有不同程度的RIF，与正常对照组相比，血清miR-29c表达明显下调，提示miR-29c表达下调可能与RIF有关。

ColⅠ在人肝癌（HepG2）体外细胞株中证实是miR-29c的靶基因[1]。本研究结果显示，CKD组患者血清miR-29c表达明显下调，ColⅠmRNA表达明显上升，两者呈负相关，这说明miR-29c负向调控ColⅠ。miR-29c的靶基因包括 ColⅠ、ColⅢ、ColⅣ、ColⅤ、原纤维蛋白、层粘连蛋白、血管内皮生长因子A等[10-11]，大部分编码ECM，血管内皮生长因子A促进ECM在内皮细胞外堆积。在CKD患者中，血清miR-29c表达明显下调，可能通过以上靶基因使ECM生成增多并促进ECM堆积而参与RIF，且miR-29c与RIF指数呈负相关，说明miR-29c可能是RIF发生、发展中的一个重要参与因子。

肾脏疾病的预后与RIF程度密切相关。肾脏穿刺活检行病理学检查能够直接反应肾组织的病理特点，目前仍是检测RIF的主要手段。但肾脏穿刺活检具有一定危险性，术后存在出血、继发感染等风险，且需重复活检了解病情进展以及评估治疗效果。miRNA在血液循环、尿液或其他体液中能够稳定存在，不易降解，被认为是最有潜力的疾病生物标志物，可反映某些疾病病变及病情严重程度。本研究结果表明CKD患者血清miR-29c表达水平随着RIF的加重而下降，提示miR-29c的表达水平可作为评价RIF严重程度的指标。实时荧光定量PCR检测血清中miRNA表达水平已经是一项成熟技术，因此，检测CKD患者血清miR-29c表达水平可作为诊断RIF以及随访的检查指标。

血清肌酐是最常用来评价肾功能的指标，血清胱抑素C作为内源性标志物，与肾小球滤过率相关性最好，其主要由肾小球滤过率决定，不受性别、肌肉容积、炎症、肿瘤影响，是反映肾功能的敏感指标[12]。本研究中CKD组患者血清miR-29c表达水平与血清肌酐、血清胱抑素C水平均呈负相关，提示miR-29c的表达水平可作为评价肾功能的辅助指标。

已有研究发现，将人工合成的miR-29c mimics转染大鼠肾间质成纤维细胞上调miR-29c，可抑制ColⅠ表达起到抗纤维化作用[9]。本研究在CKD患者中证实miR-29c负向调控ColⅠ，这为今后治疗RIF提供了新的方向。

综上所述，本研究结果显示，CKD患者血清miR-29c表达明显下调，miR-29c可能通过相应靶基因使ECM生成增多，并促进ECM堆积而参与RIF。血清miR-29c表达水平可作为诊断RIF以及随访的生物标志物，且可作为评价肾功能的辅助指标，其抗纤维化作用为临床治疗RIF提供了新的方向。