金银花根腐病的发生规律与病原鉴定

张谦 孙宗昭 王学术 鲁玉成 肖利元 王军

摘要 对金银花根腐病发生规律进行观察，并对金银花根部微生物进行分离，确定了金银花根腐病的发生规律及病原菌，通过伤口侵染造成金银花整株发病。田间调查发现，土壤环境、根系损伤程度与根腐病发病程度相关密切。

关键词 金银花;根腐病;病原;微生物

中圖分类号 S436.8+1文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）13-0129-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.13.040

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Occurrence Regularity and Pathogen Identification of Honeysuckle Root Rot

Abstract The occurrence regularity of honeysuckle root rot was observed， the microorganism in the root of honeysuckle was separated continuously， the occurrence rule and pathogenic bacteria of honeysuckle root rot were determined， and the whole honeysuckle disease was caused by wound infection. Field investigation showed that soil environment and root system damage were closely related to the incidence of root rot.

Key words Honeysuckle;Root rot;Pathogen;Microorganism

基金项目 山东省现代农业产业技术体系中草药产业创新团队建设项目。

作者简介 张谦（1967—），男，山东临沂人，高级农艺师，从事中草药规范化栽培技术研究与应用。

收稿日期 2019-01-16

金银花（Lonicera japonica Thunb.），又名忍冬。“金银花”一名出自《本草纲目》，由于忍冬花初开为白色，后转为黄色，因此得名金银花。其功效主要是清热解毒，主治温病发热、热毒血痢、痈疽疔毒等。平邑为金银花道地产区，多年保持金银花种植面积4.33万hm2，年产干花1.8万t。近几年金银花老园区占比逐年增加，疏于管理，土地板结，根腐病逐年加重。根据田间调查，2018年平邑县金银花根腐病发病率达20%～30%，减产30%以上，严重制约了金银花产业的健康发展。笔者对金银花根腐病的发生规律与病原鉴定进行研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

平邑主栽品种为中花一号。

1.2 试验地及生态特征

平邑县郑城镇武城村，株龄为4年，栽植密度为1.0 m×1.0 m，通风透光不良，植株长势中等，枝叶茂密;平邑县郑城镇巩家山村，株龄4年，栽植密度1.0 m×1.5 m，通风透光良好，植株长势较强。

1.3 病害调查

对2处具有代表性的金银花种植园采用五大点取样法，每次取样5株，重复4次，调查确定2处金银花种植区根腐病发生情况;并按常规方法进行病原菌分离培养，使用PDA培养基，在28～32 ℃恒温箱中培养3～7 d后，检查记录菌落形态等，继而利用菌悬液接种金银花根部，确定病原菌[1]。

1.3.1 病原菌的分离纯化。

每试验园确定10株不同感病程度的金银花根腐病植株，进行连续观察，按常规方法进行病原的分离培养[2]（即使用PDA培养基，在28～32 ℃恒温箱中培养3～7 d后，检查记录菌落形态）。同时，对分离出的菌株进行纯化保存。

1.3.2 病原菌株类型的确定。

对培养后的真菌病原菌株，进行菌体及孢子形态的观察，确定其病原类型[3];对细菌菌株进行菌落形态和颜色、革兰氏染色和鞭毛染色观察，确定其基本性状和特征，确定其病原类型。

1.3.3 病原菌株的致病性测定。

1.3.3.1 接种用菌株的制备。

对分离纯化的Alternatia sp、Trichothecim sp和 Fusarium sp菌株，分别在PDA培养基上培养3～7 d，使其形成足量的分生孢子[4];细菌BA1、BA2，培养2 d;分别制备1×106 CFU/mL的孢子悬浮液待用。

1.3.3.2 接种方法。

将健康金银花幼株分为2组，一组采取损伤根部用孢子悬浮液进行接种，一组直接用孢子悬浮液进行接种[5]，分刺伤和无伤2种接种处理方法，每处理10株，重复3次，以无菌水作为空白对照。接种后室温放置，连续观察发病情况。

1.4 病原菌鉴定

对分离纯化的Fusarium sp.菌株，分别在PDA培养基上培养3～7 d，使其形成足量的分生孢子。

1.4.1 DNA模板的制备。

将尖镰孢菌（Fusarium sp）的菌液分别提取全基因组DNA。具体操作：室温1 500 r/min离心5 min，去除上清。菌体重悬于3 mL ddH2O，振荡混匀;加入500 μL lysis Buffer重悬细胞，转移至1.5 mL离心管中;加入0.3 g小珠子与25 μL 5 mol/L NaCl;最大振速振荡2 min;室温2 000 r/min离心2 min，去除上清;加入550 μL酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），颠倒混匀;室温10 000 r/min 离心2 min，上清转移至新的离心管;加入550 μL氯仿∶异戊醇（24∶1），颠倒混匀;室温10 000 r/min离心2 min，上清转移至新的离心管中;加入1.1 mL预冷的95%乙醇，-20 ℃静置1 h;室温13 200 r/min离心5 min，去除上清;加入 1 mL 70%乙醇，室温吹干;加入10 μL TE 溶解基因组DNA。将达到试验要求的总DNA进行分装，分别置于4 ℃和-20 ℃保存备用[6]。

1.4.2 单一PCR扩增与检测。

病原菌尖镰孢菌目的基因CAM的PCR引物序列见表1。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。试验体系：10×PCR 缓冲液3 μL，Mg2+（25 mmol/L）15 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，Taq DNA聚合酶2.5 U，加超纯水至30 μL。单一PCR 扩增反应条件：95 ℃，5 min;（95℃，1 min;61.0 ℃/62.3 ℃/63.6 ℃/64.2 ℃/65 ℃，1 min;72 ℃，1 min）30个循环;72 ℃，10 min;10 ℃保存。PCR完成后电泳检测扩增产物，然后用GenClean柱式琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（上海捷瑞）纯化产物。将回收的DNA与pMD19-T载体进行连接、转化（感受态细胞使用DH5α），单克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

2 结果与分析

2.1 病原菌株特征

从表2可以看出，从不同病根类型中分离纯化出的主要病原可确定为BA1、BA2、Alternatia sp.、Trichothecim sp.和Fusarium sp.。其菌落形态见图1。

2.2 病原菌致病性

由表3可知，Fusarium sp.通过伤口侵染，单独和复合侵染均引起发病;而Trichothecim sp.和Alternatia sp.单独接种不引起发病，与其他病原复合接种引起发病，因此认为其为次要病原菌或非病原菌[8];BA1和 BA2在一定程度上降低了发病率，有可能是病原菌的拮抗菌。

2.3 病原菌特异性基因的扩增

用特异引物对供试菌株进行扩增，以检测PCR反应的特异性。扩增结果（图2）显示，病原菌特异性基因的引物均扩增出特异性产物CAM、16S rDNA、fliC。PCR扩增产物进行测序后，确认为各病原菌特异性产物。结果显示，病原菌的特异性引物均具有良好表现，符合镰刀病原菌的分子鉴定。

3 结论与讨论

金银花根腐病是制约金银花生产的主要因素，该研究结

果表明，金银花根腐病主要是由真菌病原F.oxysporum通过伤口侵染引起的病害。另外从田间病害的发生情况发现，不同土壤环境下金银花根腐病发生程度有差异[9]，即在土壤酸化、盐渍化的金银花种植园中，根腐病发生较重，且病根中分离获得的病原菌较多;而偏中碱性的砂质壤土的种植园[10]，病害发生较轻，且以根部有虫伤危害的植株为主[10]，F.oxysporum从病株中分离获得的概率最高;而详细情况需要进一步研究确定。

参考文献

[1] WANG J，XU T T，YIN L C，et al.Nitrate addition inhibited methanogenesis in paddy soils under longterm managements[J].Plant Soil Environ，2018，64（8）：393-399.

[2] JETTEN M S M，VAN  NIFTRIK L，STROUS M，et al.Biochemistry and molecular biology of anammox bacteria[J].Critical reviews in biochemistry and molecularbiology，2009，44（2/3）：65-84.

[3] JIA Z J，CONRAD R.Bacteria rather than Archaea dominate microbial ammonia oxidation in an agricultural soil[J].Environmental microbiology，2009，11（7）：1658-1671.

[4] JIN R C，YANG G F，YU J J，et al.The inhibition of the Anammox process：A review[J].Chemical engineering journal，2012，197：67-79.

[5] WANG J，DENG H，WU S S，et al.Assessment of abundance and diversity of exoelectrogenic bacteria in soil under different land use types[J].Catena，2019，172：572-580.

[6] GALLOWAY J N，DENTENER F J，CAPONE D G，et al.Nitrogen cycles：Past，present，and future[J].Biogeochemistry，2004，70（2）：153-226.

[7] 國家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：中国医药科技出版社，2015：221.

[8] 彭素琴，谢双喜.金银花的生物学特性及栽培技术[J].贵州农业科学，2003，31（5）：27-29.

[9] 王天志，李永梅.金银花的研究进展[J].华西药学杂志，2000，15（4）：292-294，298.

[10] 王军，施雨，李子媛，等.生物炭对退化蔬菜地土壤及其修复过程中N2O产排的影响[J].土壤学报，2016，53（3）：713-723.