柞树叶总黄酮乙醇提取工艺及抑菌活性研究

王林美 岳冬梅 孙永欣 张波 李树英

摘要 [目的]对柞树叶中总黄酮的乙醇提取工艺进行了研究，同时考察柞树叶总黄酮提取物对几种常见食源性细菌的抑菌作用。[方法]以单因素试验为基础，通过正交试验来探讨料液比、提取温度、浸提时间和乙醇浓度对柞树叶中总黄酮提取效果的影响，确定最佳提取工艺条件，并采用抑菌圈法对痢疾志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠道沙门氏菌4种常见食源性细菌进行体外抑菌活性测定。[结果]柞树叶中总黄酮乙醇提取工艺为料液比1∶20（g∶mL），提取时间90 min，提取温度60  ℃，提取剂为50%的乙醇溶液，在该条件下，提取液中的总黄酮含量达5.06%。提取物在体外对4种食源性细菌的生长均有抑制作用，抑菌活性随着样品浓度的增大而增加。对4 种供试菌的体外抑制作用由强到弱依次为痢疾志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠道沙门氏菌。[结论]柞树叶总黄酮乙醇提取工艺简单、可行，其提取物可用于天然食品防腐剂的开发。

关键词 柞树叶;总黄酮;提取工艺;正交试验;抑菌活性

中图分类号 R284.2文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）14-0171-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.14.051

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract [Objective]The extraction process of total flavonoids from oak （Querus mongolica） leaves by the ethanol was studied.Moreover， the bacteriostatic effect of total flavonoids extract on several common foodborne bacteria was studied.[Method]Based on singlefactor method， the optimum extraction conditions of the solidliquid ratio， extraction temperature， extraction time and ethanol concentration on the extraction effect of total flavonoids were investigated by orthogonal experiment.The antibacterial activity of the four target bacteria Shigella dysenteriae， Staphylococcus aureus， Escherichia coli and Salmonella enterica was determined by inhibition zone method in vitro.[ Result]The results indicated that the optimal extraction conditions of total flavonoids with ethanol included solidliquid ratio of 1∶20 （g∶mL）， extraction duration of 90 min， extraction temperature of 60 ℃，and ethanol concentration of 50%.Under this optimized conditions，the extraction rate of total flavonoids from oak leaf reaches 5.06%.The total flavonoids extracts inhibited the growth of the four foodborne bacteria， and the antibacterial activity increased with the increase of extract concentration.The inhibitory effects of the four tested bacteria were as follows：S.dysenteriae，S.aureus，E.coli，S.enterica.[Conclusion]The method is simple and feasible in operation， and the extract can be used for the development of natural food preservative.

Key words Querus mongolica leaf;Total flavonoids;Extraction process;Orthogonal experiment;Antibacterial activity

作者簡介 王林美（1966—） ，女，辽宁大连人，副研究员，从事柞树资源开发利用研究 通信作者，研究员。

收稿日期 2019-03-04;修回日期 2019-03-22

柞树为壳斗科栎属植物的总称，是多年生阔叶植物，主要分布在我国东北和华北地区，其中辽宁省柞树林有182万hm2，占林地面积的14.7%。柞树资源广泛，是一种野外自然生长的植物，其生长环境天然无污染，柞树叶无毒无害，目前主要作为柞蚕食用饲料而被利用[1]。柞树叶除了含有粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、粗纤维、矿物质元素、维生素等营养成分外，还富含黄酮类生物活性成分[2]。现代药理试验已证实，柞树叶具有清热利湿、抗炎解毒[3]、保肝、降血糖[4]的作用，黄酮类化合物在发挥这些功效方面起到至关重要的作用。柞树叶中黄酮类主要有山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、山奈酚-3-O-（6′-O-没食子酰基）-β-D-吡喃葡萄糖苷、芹菜素-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、黑麦草素、β-谷甾醇葡萄糖苷等[5]。黄酮类的化合物具有广泛的生理活性及较高的药用价值，例如：抗氧化、抗抑郁、抗衰老、保护神经、提高免疫力、抗肿瘤等功效[6-8]。因而如果能够从柞树叶中提取黄酮类化合物并将其应用于药品或者保健食品生产中，就可以大大提高柞树副产品的经济价值。

目前已有很多从天然植物中提取黄酮类化合物的报道[9-11]，其中最常见的提取方法有水浸提、有机溶剂提取、超声波和微波辅助提取以及酶解法提取等。然而，尚未有研究发现如何从柞树叶中提取黄酮类化合物。因此，笔者利用乙醇作为提取剂提取柞树叶中的黄酮类化合物，并在单因素试验的基础上，应用正交试验的方法确定总黄酮提取的最佳工艺条件，同时考察柞树叶黄酮提取物对常见食源性细菌的抑制作用，旨在为开发柞树叶天然食品保鲜剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 柞树叶来自蒙古栎（Quercus mongolica），于夏季采自辽宁省凤城市，用清水清洗后25 ℃阴干，粉碎过60目筛，得柞树叶粉，于-20  ℃冰箱中保存。

芦丁标准样品购自广州市齐云生物技术有限公司，亚硝酸钠、硝酸铝、无水乙醇、氢氧化钠等均为国产分析纯。

供试菌株痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae， CMCC51105）、大肠杆菌（Escherichia coli， ATCC25922）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， ATCC25923）、肠道沙门氏菌（Salmonella enteric， ATCC14028），均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.2 仪器 U3010紫外/可见分光光度计（Hitachi， Japan）;SENCO 5 L旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）;DZF-6021 真空干燥箱;AL104电子天平（METTLER TOLEDO，上海）;DHG-9070A 电热鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）;98-1-B电热套（上海申生科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 芦丁标准曲线的制作[12]。精密称取芦丁标准品5 mg，溶解于25 mL的甲醇溶液中，制成终浓度为0.2  mg/mL 的芦丁标准溶液，備用。分别使用精密容器量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL的标准溶液，置于25 mL的容量瓶内，分别加水至6 mL，混匀，随后加入5% NaNO2溶液1.0 mL，充分混匀，静置6 min 后，加入10% Al（NO3）3 溶液1.0 mL，混匀，静置6 min，随后加入4% NaOH 溶液10 mL，加水定容后充分摇匀，静置15 min后，以空白试剂作参比，用紫外分光光度计在波长510 nm下测定吸光度，得芦丁浓度（ρ，mg/mL）与吸光度（A）的回归方程，绘制标准曲线。

1.3.2 柞树叶总黄酮含量的测定[13]。

分别称取柞树叶粉1.0 g，置于50 mL 锥形瓶中，加20 mL 50%乙醇于60 ℃水浴中浸提90 min，提取物4层纱布过滤，5 000 r/min的条件下离心20 min，收集上清液，得柞树叶总黄酮样品待测。取1 mL待测液至50 mL容量瓶中，按照测定芦丁标准液吸光度的步骤测定吸光度（A）， 重复3次，取平均值，计算供试品中总黄酮的含量（以芦丁计，mg/g），再计算平均值。计算公式为：

供试样品中总黄酮含量（mg/g）=C·V·nW

式中，C 为供试品溶液的总黄酮浓度（mg/mL），V 为供试品溶液定容的体积（mL），n 为稀释倍数，W为称样量（g）。

1.3.3 提取单因素试验。以料液比、提取时间、提取温度和乙醇的体积分数为参考指标确定其提取的最适范围，试验重复3次，计算样品中黄酮含量。

1.3.3.1 不同料液比对柞树叶总黄酮含量的影响。分别准确称取1.00 g 柞树叶粉于250 mL容量瓶中，在乙醇体积分数为50%、温度为60  ℃、提取时间为90 min的条件下，控制料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g∶mL），按“1.3.2”方法分别提取柞树叶中总黄酮化合物并测定其含量，选择提取适合的料液比范围。

1.3.3.2 不同提取时间对柞树叶总黄酮含量的影响 。 分别准确称取1.00 g 柞树叶粉于250 mL容量瓶中，在固定乙醇体积分数为50%、温度60  ℃、料液比1∶20（g∶mL）的条件下，将提取时间分别控制在30、60、90、120和150 min，按照“1.3.2”方法从柞树叶中提取总黄酮化合物并测定其含量，筛查确定较佳的提取时间范围。

1.3.3.3 不同提取温度对柞树叶总黄酮含量的影响。  分别准确称取1.00 g柞树叶粉于250 mL容量瓶中，在固定乙醇体积分数为50%、提取时间90 min、料液比1∶20（g∶mL）的条件下，将提取温度依次控制在40、50、60、70和80  ℃，依旧“1.3.2”方法从柞树叶中提取总黄酮化合物并测定其含量，以便明确较佳的提取温度范围。

1.3.3.4 不同的乙醇体积分数对柞树叶总黄酮含量的影响。准确称取1.00 g柞树叶粉末若干份于250 mL容量瓶中，在固定温度60 ℃、提取时间90 min、料液比1∶ 30（g∶mL）的条件下，在乙醇体积分数分别为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%的条件下，按“1.3.2”方法从柞树叶中提取总黄酮化合物并测定其含量，从而获得较佳的提取乙醇体积分数范围。

1.3.4 正交试验设计。以控制单一变量为基础，以乙醇体积分数（A）、料液比（B）、提取温度（C）、提取时间（D）4个因素为变量，分别各设定3个水平，按照L9（34）正交表（表1）进行正交试验，确定从柞树叶中提取总黄酮化合物的最佳条件。

1.3.5 抑菌试验及抑菌活性测定。

1.3.5.1 营养琼脂培养基的配制。将牛肉膏3 g、蛋白胨10 g及氯化钠5 g溶解于1 000 mL蒸馏水中，用150 g/L氢氧化钠溶液调pH至7.2～7.4，加入20 g琼脂，加热煮沸使琼脂融化，分装于烧瓶内，并于121 ℃下高压灭菌15 min[14]。

1.3.5.2 营养肉汤培养基的配制。将牛肉膏3 g、蛋白胨10 g及氯化钠5 g溶解于1 000 mL蒸馏水中，调节pH 7.4，分装于各试管、烧瓶内，121 ℃下高压灭菌15 min。

1.3.5.3 菌悬液及不同浓度柞树叶总黄酮提取液的制备。将供试菌株用相应斜面培养基活化培养24 h，用接种环挑取一环菌体放入装有9 g/L无菌氯化钠的锥形瓶中，充分摇匀，用血球计数板计数，配制成浓度为5×106cfu/mL的菌悬液，备用。取0.5 g/mL柞树叶总黄酮提取液，采用二倍稀释法[15]稀释为浓度500、250、125、62.5、31.25、15.625 mg/mL，备用。

1.3.5.4 抑菌试验及抑菌活性测定。在直径为9 cm的培养皿中加入15 mL营养肉汁琼脂培养基，分别吸取上述各种菌悬液0.5 mL加入培养基中，混匀，凝固后每个培养皿等距离放置5个灭菌牛津杯，于其中分别滴加0.2 mL的不同浓度柞树叶总黄酮提取液，对照滴加9  g/L无菌氯化钠溶液，每种供试菌设置5个平行试验，在37  ℃条件下培养24 h，移去牛津杯，测量各组试验的抑菌圈直径。试验重复3次，取平均值。

1.4 数据处理及分析 利用SPSS 19.0软件及Excel 2010对所得试验数据进行整理、分析和制图。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线 根据试验方法中“1.3.1”，用紫外分光光度计测定510 nm 处不同浓度梯度的芦丁标准品溶液的吸光值，以芦丁标准品的浓度（x）作为横坐标，吸光度（y）为纵坐标，绘制标准曲线，结果如图1所示。用最小二乘法经线性回归，得回归方程：y=13.779x-0.000 5（R2=0.999 5）。结果表明，溶液浓度控制在8～48 μg/mL范围内，芦丁对照品溶液浓度与吸光度呈现良好的线性关系。

2.2 不同因素对总黄酮提取量的影响

2.2.1 料液比。该试验中，在提取时间90  min、提取温度60 ℃、乙醇浓度50%恒定不变的條件下，料液比对柞树叶总黄酮化合物提取量的影响结果见图2。由图2可见，在一定范围内，从柞树叶中提取出的总黄酮化合物的含量随着试验中料液比的增加而增多，这可能是由于料液比对溶剂传质过程速度的影响，料液比越大，溶剂的传质速度越快，越有利于黄酮类化合物的浸出[16];当料液比为1∶20（g∶mL） 时，柞树叶的总黄酮提取量最高，为（4.97±0.06） mg/g;而当料液比继续增大时，总黄酮化合物的提取量反而开始下降。可见，随着料液比的浓度增加到一定程度时，黄酮类化合物在溶剂中的浸出会达到一种饱和的状态，致使其浸出受阻[10]，故料液比控制在1∶20时为最佳提取条件。

2.2.2 提取时间。在料液比1∶20、提取温度60 ℃、乙醇浓度50%的条件下，提取时间对柞树叶总黄酮提取量的影响见图3。由图3可见，柞树叶总黄酮提取量随着提取时间的增加而提高，当提取时间控制在90  min时，黄酮提取量最高，为（4.98 ± 0.06） mg/g;当时间超过120  min后，总黄酮的提取量开始略有下降，随着提取时间的继续延长，其提取量维持在一个相对稳定的状态，增加的幅度基本不明显（P>0.05），但提取时间过长并不利于工业化生产。因此，在控制其他因素不变的情况下，最佳提取时间应为90  min。

2.2.3 提取温度。在料液比1∶20、提取时间90  min、乙醇浓度50%的条件下，提取温度对柞树叶总黄酮提取量的影响结果见图4。由图4可见，当温度控制在一定范围内时，随着温度的升高，由于溶剂效应和热效应的影响，使得分子运动速率加快，有利于黄酮类化合物向细胞外的溶出[17]，总黄酮提取物的含量也随之增加。当温度超过乙醇的沸点时，乙醇会产生挥发，温度过高可能引起柞树叶黄酮类化合物提取量的降低，这可能是由于高温使其结构被氧化破坏。当温度超过60 ℃时，总黄酮的提取量开始下降;当温度达到60 ℃时，柞树叶总黄酮提取量最高，为（5.00 ±0.07） mg/g。故柞树叶中黄酮化合物提取的最佳温度是60 ℃。

2.2.4 乙醇体积分数。在料液比1∶20、提取时间90  min、提取温度60 ℃的条件下，乙醇体积分数对柞树叶总黄酮提取量的影响结果见图5。由图5可见，控制其他因素不变的情况下，乙醇体积分数在10%～50%范围内时，总黄酮类化合物的提取量与之呈正相关;当体积分数达到50%时，提取量达到最高，为（4.98±0.07） mg/g;随后总黄酮的提取量与乙醇体积分数呈负相关。当乙醇体积过小时，该浓度不能够将黄酮类化合物溶出细胞外，导致提取液中总黄酮量较低;当乙醇体积过大时，该浓度使得细胞外渗透压加大，黄酮类化合物的提取量受到影响。因此乙醇体积分数控制在50%时，柞树叶总黄酮的提取量最大。

2.3 柞树叶总黄酮提取正交试验结果及分析 在单因素试验结果的基础上，将乙醇体积分数、料液比、提取温度和提取时间4个因素按照表1设计L9（34）正交试验，从而确定9组不同的试验组合，研究各因素对柞树叶总黄酮提取量的影响，结果见表2，方差分析结果见表3。由表2可见，RA>RD>RB>RC，即柞树叶总黄酮提取量对各因素的敏感度排序为乙醇体积分数（A）>提取时间（D）>料液比（B）>提取温度（C）。方差分析进一步验证，各个影响因素对提取率影响达到极显著水平（P<0.01）。Duncans多重比较结果表明，从柞树叶中提取总黄酮的最佳工艺为A3B2C3D2，即提取乙醇体积分数为50%，料液比为1∶20，提取温度为60 ℃，提取时间为60 min，在该条件下总黄酮提取含量为5.06%（相对于被提取的柞树叶质量）。

2.4 抑菌活性 由表4可见，柞树叶总黄酮提取物溶液对4 种供试菌均有一定的抑制作用，对痢疾志贺氏菌的抑制效果最好，其次为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肠道沙门氏菌。在柞树叶总黄酮提取物溶液浓度低于62.5 mg/mL 时，对4种供试菌抑制作用不明显;提取物溶液浓度低于125 mg/mL 时，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肠道沙门氏菌抑制作用不明显;提取物溶液浓度低于250 mg/mL 时，对肠道沙门氏菌抑制作用不明显。由抑菌圈直径大小可见，柞树叶总黄酮提取物溶液对各供试菌的抑制作用随着浓度的增大而增加。