山东省某规模鸡场传染性支气管炎病毒诊断及细菌分离鉴定与药敏分析

王苗利 陈静 楚遵锋 汪洋 王敏 李玉杰 刘丽平

山东省某规模鸡场传染性支气管炎病毒诊断及细菌分离鉴定与药敏分析

王苗利 陈静*楚遵锋 汪洋 王敏 李玉杰 刘丽平

（山东省动物疫病预防与控制中心 济南 250022）

2018年7月，山东省诸城市某规模肉鸡场出现个别鸡瘫痪，稀便，采食量略微偏低，生长速度偏慢。大群无呼吸道症状。20日龄后发病数量居多，约占到大群的千分之五。实验室对送检的8只鸡病料进行了病毒pcr鉴定、细菌分离鉴定及药敏分析。鉴定得出传染性支气管炎病毒阳性，分离到革兰氏阴性杆菌；通过生化鉴定结果为大肠杆菌；根据药敏结果及病毒检测结果对该肉鸡场进行科学用药，降低了滥用药、过度用药对鸡场带来的危害。

病毒检测 细菌分离 药敏分析 传染性支气管炎 大肠杆菌

鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis，IB)是鸡群中常见的一种呼吸道症状的传染病，其特点为急性爆发，传染性很高，在我国及世界范围内广泛分布，给养鸡业造成了很大的危害。其感染病原为禽传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)，IBV为RNA病毒，核酸为单股正链型，同时RNA病毒聚合酶在遗传扩增过程中缺乏校正能力，使得IBV较容易发生变异，很多研究人员发现新的基因型和血清型[1]。研究人员发现不同血清型和基因型的毒株造成免疫保护不理想，这给本病免疫预防方面带来了困难。所有日龄的鸡均可以感染此病，但雏鸡感染最严重和最容易，鸡的呼吸系统和泌尿系统为IBV主要遭受侵害的两个系统[2]，从而导致鸡生长缓慢、料肉比降低等，剖检可见气管有出血，肾脏等内脏器官等发生病变，IBV感染鸡群后造成鸡免疫下降，从而造成大肠杆菌和霉形体的继发感染，最终造成鸡群大面积死亡，给养鸡业造成巨大损失。不同研究人员已经从鸡的呼吸系统、生殖系统、消化系统等组织器官中分离得到IBV，并且鸡群感染IBV后会继发多种疫病，给养鸡业造成了巨大的损失，禽传染性支气管炎仍然是国内外研究的重要禽病之一。大肠杆菌病是养鸭场最常见的细菌病之一。大肠杆菌既可以水平传播，也可以垂直传播，主要引起鸭的卵黄吸收不全、心包炎、气囊炎、肝周炎[3]，本菌由于很容易产生耐药性，实际生产中感染途径及感染原因不一，临床治疗越来越复杂。

近年来，禽病感染发病原因越来越复杂，病毒和细菌的混合感染临床病例越来越常见，再加上抗生素的滥用，细菌的耐药性越来越强，给临床诊断带来了很大的困难。因此，根据实验室诊断以及科学的药敏分析，合理的指导用药治疗，成为今后发展的趋势，相信如果广大养殖用户都能科学、合理的用药，一定会改善抗生素滥用、细菌耐药性增强的现象，减少抗生素给禽以及人类带来的危害，更好的应对禽场的疫病防控。

1 材料与方法

1.1 试验材料 荧光定量PCR仪(罗氏)、鸡传染性支气管炎病毒荧光定量PCR试剂盒(生科尚仪)、显色培养基、营养琼脂、革兰氏染色液、奥林巴斯显微镜、梅里埃生化及药敏仪(VITECII compact60)。

1.2 临床发病情况 2018年7月，山东省潍坊市诸城市某规模肉鸡场出现个别鸡表现瘫痪，稀泻。经过调查了解，该场饲养14万只817肉鸡，近7天开始出现了个别鸡瘫痪情况，病鸡14日龄开始出现拉稀情况，采食量比正常鸡群略微偏低，生长速度偏慢，发病鸡约占到大群的千分之五；大群无呼吸道症状。实验室接到场主送检的样本后，立即开展检验，并根据检验结果指导用药，得到了良好的效果。

1.3 剖检病变 腺胃壁增厚，腺胃肿胀，胆囊肿大，小肠壁增厚，内有大量液体。肾脏、气囊、心包未见明显病变。

1.4 病毒检测 选取送检病料的肝脏、淋巴结、脾脏、气管等部位组织样品，经过研磨处理后使用核酸提取仪提取病毒核酸，并根据检测试剂盒的操作步骤进行操作，通过荧光定量PCR仪进行pcr扩增，并读取结果。

1.5 细菌鉴定及药敏分析 选取送检病料的肝脏、肺脏在显色平板上进行接种，挑取显色平板上培养出的细菌进行革兰氏染色，100倍油镜观察细菌形态。结合镜检结果及培养基培养出的细菌颜色、形态的不同，挑取单菌落，三线划线法纯化到营养琼脂平板上，将营养琼脂平板倒置放于温箱中，37°C培养18~24h。根据染色镜检结果，选择合适的鉴定、药敏卡片；无菌操作，分别挑取纯化的单菌落制备菌悬液，浓度控制在0.5~0.63Mc浓度，备装鉴定卡片；将鉴定卡片和药敏卡片分别插入制备好的菌悬液中，做好标记，装载上机，5~18h后读取结果。

2 结果

2.1 病毒检测结果 经过病毒荧光pcr检测，ct值为26.0，ct值小于30.0，判定为传染性支气管炎病原阳性。

2.2 病料接种培养结果 经过温箱37°C培养18-24h后，取出平板，观察到平板上长出两种细菌，分别为紫红色和黄色的菌落。

2.3 细菌染色镜检结果 经过革兰氏染色，确定平板上长出的细菌为革兰氏阴性杆菌。

2.4 细菌生化鉴定及药敏分析 根据镜检结果，选择GN革兰氏阴性杆菌鉴定卡片和GN13革兰氏阴性杆菌药敏卡片，并制备菌悬液并上机；经过鉴定和药敏分析，鉴定结果为大肠杆菌，见表1，药敏结果见表2。

表1 大肠杆菌生化结果

表2 大肠杆菌药敏结果

由表1可知，生化结果符合大肠杆菌生化谱，置信度极好的鉴定结果，符合率为99%；由表2可知，此大肠杆菌首选药依次为头孢吡肟、妥布霉素。

3 讨论

结合此次药敏实验的结果，以及考虑较小的血药浓度，建议此鸡场选择氨苄类抗生素治疗，血药浓度控制在1ug/ml，防止滥用药、过度用药，造成微生物生态失衡、耐药菌株的增加的现象。另外，大肠杆菌是常见的传染性病原菌，建议养殖场在日常中注意生物安全的科学管理，舍内、舍外定期消毒，减少病原菌的繁殖；及时清理病死禽及粪便，并做无害化处理；定期对场内鼠类等动物进行灭杀；减少外来兽医等人员带来的感染风险；减少与场外禽类的接触风险。

4 结论

通过实验室检测，确定该鸡场发病的致病菌原为传染性支气管炎病毒、大肠杆菌，推测是由传染性支气管炎病毒感染引起的，大肠杆菌继发感染造成的鸡群发病，建议加强饲养管理、合理用药、定期消毒，减少外来风险。

[1] 1 Li M1, 2 Wang XY, 3 Wei P, 4 Chen QY, 5 Wei ZJ, 6 Mo ML. Serotype and genotype diversity of infectious bronchitis viruses isolated during 1985-2008 in Guangxi, China[J]. Arch. Virol：2012, 157: 457-474.

[2] Cavanagh D and Naqi S A. Infectious Bronchitis. In B.W.Calnek,H.J.Barnes, C.W. Breard,L.R. McDougald and Y.M.Saif(Eds.).Diseuses of Poultry：1997, 10th edn(pp.511-526).

[3] 宋修庆. 鸭场大肠杆菌病的危害与防治[J]. 禽病防治：2011(10):30-31.

（2018–10–29）

山东省家禽产业体系创新团队：SDAIT-11-13；病死畜禽无害化处理技术推广；国家重点研发计划项目(The National Key Research and Development Program of China)-肉鸡养殖废弃物资源化利用技术集成与示范，项目编号：2018YFD0501405

S858.31

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1007-1733(2019)08-0017-02