检测4种有机磷农药胶体金免疫层析试纸条的研制

朱亮亮 王琳琛 王兆芹 崔海峰 张坤 冯才伟 万宇平*

检测4种有机磷农药胶体金免疫层析试纸条的研制

朱亮亮①③王琳琛①③王兆芹②崔海峰①③张坤①③冯才伟①③万宇平*①③

（①北京勤邦生物技术有限公司 北京 102206 ②北京望尔生物技术有限公司 北京 ③北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心）

本文通过制备有机磷农药半抗原，研制出一种能够检测蔬菜、水果中有机磷农药的胶体金免疫层析试纸条，辛硫磷、对硫磷、丙溴磷、氯唑磷等有机磷农药的检测限均为200μg/kg，检测时间仅为15min，假阳性率和假阴性率均为0，符合《农残办技术材料要求及审查程序》要求，试纸条能够应用到基层实验室的大批量样本检测，具有实际意义。

有机磷农药 胶体金免疫层析试纸条 快速检测

有机磷农药是一种含有磷元素的有机化合物农药，它种类多，药性强，农业生产中常常用作杀虫剂。然而，不科学地使用农药导致了蔬菜瓜果的农药残留超标，威胁到人类的健康，严重地还会对人的脏器、生殖系统等造成损坏，影响代谢功能[1-3]。因此，我国规定了食品中农药残留限量要求。农业部、国家卫计委、食监局联合发布2016年第16号公告《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》(GB2763-2016)等107项食品安全国家标准，公布了相关限量标准所涉及的食品中农药产品残留量的检测方法。

目前，检测有机磷农药的多为仪器方法，比如气相色谱-质谱法、高效液相色谱-串联质谱法、高效液相色谱法、气相色谱法、液相色谱-串联质谱法等[3-14]。仪器方法较难应用于基层实验室的大批量样本检测，因此本文介绍的有机磷农药胶体金免疫层析试纸条较好地解决了该问题。该试纸条能够检测蔬菜、水果中的有机磷农药(对硫磷、辛硫磷、丙溴磷、氯唑磷)残留，灵敏度较高、检测时间短、检测方便，是理想的初筛方法，并具有实际应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

对硫磷、辛硫磷、丙溴磷、氯唑磷等标准品(纯度≥95%)购自北京标准物质研究中心，氯金酸(HAuCl4·3H2O)、牛血清白蛋白(BSA)均购自美国Sigma公司，柠檬酸三钠、碳酸钾购自北京百欣试剂公司；样本提取剂、样本复溶液、胶体金分析仪由北京勤邦生物技术有限公司提供；涡旋仪、均质器均购自湖南湘立科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 有机磷农药半抗原的制备 （1）取化合物a 1.0g，加甲醇30ml溶解，取盐酸羟胺0.27g，加水1ml溶解，加入到甲醇溶液中，加碳酸钾0.46g，加热回流24h，停止反应，冷却到室温，得到A液；取锌粉0.31g，加水5ml，搅拌，加冰乙酸0.2ml，90℃搅拌30min，加入全部的A液，继续搅拌4h，停止反应，加水100ml，乙酸乙酯70ml×3，萃取三次，合并有机相，蒸干，乙酸乙酯/正己烷(v/v，1/10)120ml重结晶，得到化合物b0.81g，收率81%；（2）取化合物b 0.81g，加氢溴酸50ml溶解，100℃回流反应3h，停止反应，加6mol/L氢氧化钠溶液调节pH值到7，加乙酸乙酯100ml×3，萃取三次，合并有机相，蒸干，上硅胶柱，乙酸乙酯/石油醚(v/v，1/5)洗脱，得到化合物c 0.7g，收率92.1%；（3）取化合物c 0.7g，加甲醇30mL溶解，加二乙氧基-氯硫磷0.55g，加KOH 0.78g，55℃反应5h，停止反应，加水，加6 mol/L盐酸调节pH值到6，加二氯甲烷120ml×3，萃取三次，合并有机相，蒸干，无水乙醇/乙腈(v/v，1/1)60ml重结晶，得到化合物d 1.3g，收率86.67%，即为半抗原产物。

图1 有机磷农药半抗原合成

1.2.2 有机磷农药半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联物合成 取化合物d半抗原产物38mg，加DMF 2ml溶解，加N-琥珀酰亚胺17mg，加EDC 29mg，室温搅拌2h，得到半抗原活化液A液；取牛血清白蛋白100mg，加0.05mol/L CB缓冲液溶解，得到B液，将A液滴加到B液中，4℃搅拌24h，0.02mol/L PB缓冲液透析纯化3d，每天换液3次，得到有机磷-BSA免疫原，-20℃保存备用。

1.2.3 有机磷农药单克隆抗体-胶体金标记物的制备 在磁力搅拌下，用0.2mol/L Na2CO3溶液调节胶体金溶液的pH值至7.2，每毫升胶体金溶液中加入70μg有机磷农药单克隆抗体，混匀，静置10min，加入10% BSA，使其在胶体金溶液中的体积百分含量为1%，静置10min。离心、洗涤、重悬，置4℃备用。

1.2.4 将有机磷农药单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔试剂上 将100μl有机磷农药单克隆抗体-胶体金标记物加入到微孔试剂微孔板中，置于冷冻干燥机，冷阱温度为-50℃，预冻3h，再真空干燥15h，即得到有机磷农药单克隆抗体-胶体金标记物冻干的微孔试剂。

1.2.5 检测方法 向微孔中加入100ml待检样本溶液，混匀，室温下孵育3min，吸取70ul滴至试纸条上，反应10min，根据示意图判定结果或通过胶体金分析仪读取检测结果。其它时间判读无效。

图2 有机磷农药胶体金试纸条结果判定示意图

1.2.6 样本检测限 在空白白菜、苹果样本中分别添加有机磷农药(对硫磷、辛硫磷、丙溴磷、氯唑磷)标准品至质量浓度为0、100、150、200、250、300μg/L，用三批试纸条进行检测，每个浓度重复5次，根据实验结果确定样本检测限。

1.2.7 试纸条的特异性 分别配制500μg/L的克百威、呋喃丹和敌敌畏等药物，用此试纸条检测，重复3次，判断试纸条的特异性。

1.2.8 准确性 农业部文件要求：以假阳性率和假阴性率表示胶体金免疫层析法的准确性。取50份空白白菜、苹果样品，分别添加有机磷农药质量浓度至200μg/kg，用该试纸条进行检测有机磷农药药物残留，计算假阳性率和假阴性率。《农残办技术材料要求及审查程序》规定：试纸条假阳性率应小于5%，假阴性率应为零。

1.2.9 试纸条的稳定性 将试纸条保存于2~8℃环境中，每隔1个月检测试纸条的准确性，连续测定15个月。具体方法为：分别检测20份空白白菜、苹果样品，添加有机磷农药质量浓度至200μg/kg，重复测定2次，根据实验结果判定试纸条的稳定性。

2 结果与分析

2.1 样本检测限

配置有机磷农药浓度分别为0、100、150、200、250、300μg/L的蔬菜、水果样品，按照1.2.6步骤进行检测，确定检测限。该试纸条的检测限为200μg/kg，见表1。

表1 有机磷农药快速检测试纸条的检测限 (μg/L)

注：- 表示阴性，+ 表示阳性。

2.2 特异性

该试纸条检测500μg/L的克百威、呋喃丹和敌敌畏等药物，结果均呈阴性，表明该试纸条特异性较好。

2.3 准确性

用试纸条检测50份空白蔬菜、水果样品，检测结果均为阴性，说明假阳性率低于5%；添加有机磷农药质量浓度为200μg/kg的50份阳性蔬菜、水果样品，试纸条检测结果均为阳性，说明试纸条假阴性率为零，符合《农残办技术材料要求及审查程序》要求。

2.4 稳定性

12个月内，试纸条的假阳性率和假阴性率均符合要求，从第13个月起，试纸条会出现少量失效、假阴性等现象。

3 讨论

目前，利用仪器方法检测有机磷农药的文献较多，但是利用胶体金免疫层析试纸条能够同时检测4种有机磷农药的文献较少。刘莹在《有机磷农药的胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制》一文记录了能够检测9种有机磷农药(杀螟硫磷、甲基对硫磷、对硫磷、杀扑磷、甲拌磷、毒死蜱、三唑磷、喹硫磷、倍硫磷)残留的试纸条检测方法，检测限在250~1500μg/kg[15]。丁国兴等人在《酶促反应试纸条快速检测有机磷农药》一文中记录了用酶促反应试纸条检测敌敌畏、甲基对硫磷、灭多威、异丙威、涕灭威等6种有机磷农药的技术方法，灵敏度为2000μg/kg[16]。王菡等人在《胶体金侧向流免疫层析技术检测有机磷农药残留》一文中记录了检测毒死蜱的胶体金技术，检测限为4000μg/kg[17]。经过查阅有机磷快速检测相关文献，尚未发现能够同时检测辛硫磷、对硫磷、丙溴磷、氯唑磷等4种有机磷农药，并且检测限为200μg/kg的文献。

本文通过制备有机磷农药半抗原，让其与载体蛋白偶联得到免疫原，最终制备出商品化的胶体金免疫层析试纸条。按照《农残办技术材料要求及审查程序》要求，对试纸条进行了特异性、准确性、稳定性等性能测试，均符合要求。试纸条的检测时间仅为15min，比现有文献中仪器方法用时更短，操作更简便。试纸条检测限为200μg/kg，未见免疫方法相关文献报道。

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（2019–05–23）

典型性农残多靶标高效快速检测技术研究与应用（Z181100009318006）项目资助

S859.79+7

A

1007-1733(2019)08-0010-03