基于网络药理学研究左金丸治疗高血压的分子机制

王 君， 陈奕玮， 赵 坤， 赵光耀， 蒋文雯

（贵州大学， 贵州 贵阳550000）

高血压作为一种最常见的慢性疾病, 常伴有头晕、 头痛、 颈项板紧、 疲劳、 心悸等症状, 随着人口老龄化加剧,其发病率每年都呈持续增长的状态, 给患者、 家庭、 社会造成了严重的负担。 左金丸出自朱丹溪名方, 由黄连、 吴茱萸以6 ∶1 比例配伍而成, 方中吴茱萸性温, 入肝、 肾、脾、 胃经, 上可温胃散寒, 下可温暖肝肾, 又能降逆止呕；黄连性寒, 归心、 脾、 胃、 肝、 胆、 大肠经, 清热燥湿,邪火解毒, 具有抗肿瘤、 降压降脂等活性。 临床研究证实,左金丸降压作用比尼莫地平缓慢、 持久、 平稳, 疗效确切[1], 但其分子作用机制尚未阐明。

中药复方具有多成分-多靶点-多途径的特点, 现有研究手段难以有效说明其作用机制。 网络药理学是随基因组学、 蛋白组学、 系统生物学发展应运而生的, 通过网络拓扑分析来观察药物对病理网络的干预与影响, 揭示多分子药物协同作用于人体的奥秘, 这与中医学从整体角度去诊治疾病的理论, 以及中药及其复方多成分、 多途径、 多靶点协同作用的原理殊途同归, 无疑为跨越中西医间的鸿沟架起了桥梁[2], 也为中医药现代化和国际化指明了方向。本研究通过网络药理学研究左金丸潜在活性成分、 关键靶点、 主要通路, 为揭示该制剂治疗高血压的科学内涵提供了参考。

1 方法

1.1 活性成分虚拟筛选与ADME 分析 通过查阅大量文献, 收集左金丸已报道的所有活性成分, 同时依托中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP 收集中吴茱萸、 黄连主要活性成分。 该数据库给每个化合物提供了详细的吸收、分布、 代谢、 排泄（ADME） 参数, 可通过限制口服吸收利用度（OB）、 药物相似性 （DL）、 Caco-2 细胞渗透性（Caco-2）、 血脑屏障（BBB）、 半衰期（HL） 等参数, 虚拟筛选活性成分。

1.2 活性成分靶点预测 利用TCMSP 数据库、 STITCH 数据库（http： / /stitch. embl. de/）、 SwissTarget 数据库（http： / /www. swisstargetprediction. ch/） 预测活性成分的作用靶点, 并剔除重复靶点。 靶点相应基因通过检索Uniprot中的Uniprot KB 数 据 库Uniprot （http： / /www. uniprot.org/）, 检索方式为“organism： ‘homo sapiens’ AND reviewed： yes”, 将检索结果以Excel 格式导出, 即得Uniprot数据库中人类相关靶蛋白及其对应基因[3]。

1.3 活性成分-靶点网络构建 将活性成分及其对应的靶点输 入 Cytoscape 3.6.0 软 件 （http： / /www. cytoscape.org/）, 构建两者网络。

1.4 高血压靶点筛选 在OMIM 数据库（http： / /omim.org/）、 PharmGkb （https： / /www. pharmgkb. org/）、 TTD（http： / /bidd. Nus. edu. sg/group/cjttd/）、 DrugBank （http： / /www. drugbank. ca/）、 GAD 数据库（http： / /geneticassociationdb. nih. gov/） 中输入关键词Hypertension, 搜索与高血压相关疾病靶点, 并去除重复基因[4], 即得。

1.5 药材-活性成分-关键靶点-疾病网络构建 根据“1.3” “1.4” 项下结果, 应用Cytoscape 3.6.0 中的关联（Merge） 功能, 将2 个结果合并成药材-活性成分-关键靶点-疾病网络图, 成分靶点图和疾病靶点图交集部分即治疗高血压的关键靶点, 再通过NetworkAnalyzer 工具计算网络拓扑参数。 Degree 是指一个节点与其他节点相连的数目,本研究分析Degree≥5 的活性成分。

1.6 靶点类型归属 DisGeNET （http： / /www. disgenet.org/web/DisGeNET/menu） 是1 个包含与人类疾病相关的基因和变异的数据库。 选择靶点检索后, 依次输入关键靶点,得到靶点类型相关信息[5]。

1.7 蛋白相互作用网络构建与分析 String 数据库（https： / /string-db. org/） 是一种包含已知和预测蛋白质-蛋白质相互作用的数据库, 收集了大量蛋白相互作用关系, 共涉及9 643 763 个蛋白, 1 380 838 440 个相互作用, 包括实验检测、 生物信息学方法预测得到的数据。 将上述关键靶点导入String 数据库, 限定物种为人, 最低相互作用阀值设为中等置信度0.4 “medium confidence”, 其余参数保持默认设置, 获取蛋白相互作用关系。 图中节点之间连线越粗, 表明关联度越大。

1.8 GO 生物过程、 KEGG 通路富集分析 在DAVID 6.8数据库（https： / /david. ncifcrf. gov/） 基因列表中输入关键靶点的基因名, 在基因标识符栏中选择“official-genesymbol”, DAVID 平台列表与背景均设置为“Homo sapiens”（人类）, 分析工具选择“functional annotation tool”。 根据P＜0.01、 靶点数量（Count） ≥3 筛选出GO 生物过程和KEGG 通路。

2 结果

2.1 活性成分及ADME 参数 共搜集到224 种成分, 其中吴茱萸176 种, 黄连48 种, 再对其ADME 参数进行筛选,条件为OB≥30%, DL≥0.18, Caco-2≥-0.4, 发现25 种（其中小檗碱是吴茱萸、 黄连共有的成分） 符合条件, 作为候选化合物。 但查阅文献发现, 目前研究的黄连-吴茱萸药对主要功效物质基础也包括柠檬苦素、 药根碱、 非洲防己碱[6], 故也将三者纳入候选化合物。 见表1。

2.2 活性成分靶点 共得到80 个活性成分靶点, 并将其输入UniProt 数据库, 转换成对应的基因名称。

2.3 活性成分-靶点网络 共有108 个节点, 406 条边, 见图1。

2.4 高血压靶点 分别在OMIM 数据库、 PharmGkb、TTD、 DrugBank、 GAD 中发现35、 120、 59、 1、 12 个高血压潜在作用靶点, 剔除重复靶点后得到210 个。

2.5 药材-活性成分-关键靶点-疾病网络 共有47 个节点,154 条边, 见图2。 Degree≥6 的活性成分有（R） -四氢小檗碱（Degree = 11）、 1-甲 基-2-壬 基-4-喹 诺 酮 （Degree =11）、 吴茱萸酰胺甲（Degree=10）、 β-谷甾醇（Degree=9）、 氧化小檗碱（Degree=7）、 小檗碱（Degree=6）、 吴茱萸碱（Degree=6） 等, 度值越大, 表明左金丸通过该成分治疗高血压的可能性越大, 见表2。

表1 左金丸中活性成分及ADME 参数

图1 左金丸活性成分-靶点网络

2.6 关键靶点类型 将图2 中18 个关键靶点输入DisGeNET 数据库中, 得到靶点类型相关信息, 见表3, 可知受体最多（10 个）, 其次是氧化还原酶（3 个）、 转移酶（1个）、 转录因子（1 个）、 水解酶（1 个）、 分子伴侣（1 个）。

2.7 蛋白相互作用网络 String 数据库构建的蛋白相互作用网络中包含16 个靶蛋白节点（PDE3A、 NR3C2 未参与蛋白互作）, 共有20 条相互作用连线, 其中度值较大的有Degree=5 的α-1B 肾上腺素能受体（ADRA1B）、 Degree=4的毒蕈碱乙酰胆碱受体M5 （CHRM5）、 Degree=4 的5-羟色胺2 A 受体（HTR2A）、 Degree=4 的α-1D 肾上腺素能受体（ADRA1D）、 Degree = 4 的α-1 A 肾 上 腺 素 能 受 体（ADRA1A） 靶蛋白, 均与其他蛋白相互作用较强。 见图3。

图2 左金丸药材-活性成分-关键靶点-疾病网络

表2 左金丸药材-活性成分-关键靶点-疾病网络拓扑分析

表3 左金丸关键靶点类型

2.8 GO 生物过程、 KEGG 通路富集分析 将图2 中18 个关键靶标输入DAVID 6.8 数据库, 根据P＜0.01 且靶点数量≥3 筛选出16 个GO 生物过程、 7 条KEGG 通路。 左金丸治疗高血压的作用机制可能与腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号通路、 血管收缩的正调节、 细胞-细胞信号传导、 平滑肌收缩的正调节、 去甲肾上腺素-肾上腺素血管收缩参与全身动脉血压的调节等生物过程相关, 见表4。 另外, 关键靶标显著富集于环鸟苷酸-蛋白激酶G 信号通路（cGMP-PKG 信号通路）、 钙信号通路、 神经活性配体-受体相互作用、 唾液分泌、 心肌细胞中的肾上腺素能信号传导、调节脂肪细胞中的脂肪分解、 血管内皮生长因子信号通路（VEGF 信号通路） 等, 见表5。

表4 左金丸GO 生物过程分析

表5 左金丸KEGG 通路富集分析

图3 左金丸蛋白相互作用网络

3 讨论

左金丸以黄连为主, 佐以吴茱萸, 两者比例为6 ∶1,其药理研究方向主要集中在抗癌、 抗溃疡、 对胃肠功能的影响、 不同配伍比例对药效的影响等, 近年来研究显示它还有降血压的功能, 但具体机制不清楚。 本研究通过网络药理学研究左金丸治疗高血压的分子机制, 从药材-疾病-关键靶点-疾病网络中发现, （R） -四氢小檗碱、 1-甲基-2-壬基-4-喹诺酮、 吴茱萸酰胺甲、 β-谷甾醇、 氧化小檗碱、小檗碱、 吴茱萸碱的Degree 远高于其他成分, 表明它们可能是降压的主要药效基础, 其中（R） -四氢小檗碱属于四氢异喹啉类生物碱, 具有抗高血压、 抗心律失常、 抗纤维性颤动、 抗急性心肌梗死、 防治缺血再灌注损伤作用[7]；1-甲基-2-壬基-4-喹诺酮属于喹诺酮类生物碱, 是影响血压的重要成分, 在1 ～100 μmol/L 范围内均可不同程度地抑制去甲肾上腺素和高钾引起的血管收缩, 并可通过血管α1受体、 钙离子通道2 个途径达到血管扩张、 舒张平滑肌的作用[8-9]； 吴茱萸酰胺甲属于吲哚类生物碱, 目前对其药理活性的研究较少, 可能与其他成分协同作用来降低高血压；肖志彬等[10]报道, β-谷甾醇具有抗炎、 抑制肿瘤、 免疫调节、 抗高血脂、 镇痛、 促进伤口愈合等广泛药理活性, 炎症介导血管损伤是血压升高的病理基础, 而该成分可能正是通过减少炎症反应来发挥降压作用； 吴茱萸碱作为吴茱萸主要有效成分, 口服生物利用度最高（86.02%）, 能较好地被胃肠道吸收, 还具有镇痛消炎、 调节体温、 调节免疫系统、 减肥等作用[11]； 小檗碱为黄连主要有效成分, 属异喹啉类生物碱, 其心血管药理作用包括降低血压、 抗心律失常、 调节脂代谢、 抗动脉粥样硬化、 改善顽固性心衰等[12], 以上报道与本研究结果相互印证, 表明网络药理学的研究左金丸治疗高血压的分子机制具有科学性。

靶蛋白 ADRA1A、 ADRA1B、 ADRA1D、 CHRM5、HTR2A 在蛋白相互作用网络中的Degree 值较高, 表明左金丸可能通过以上靶点达到降压疗效。 丛科等[13-14]报道,ADRA1A、 ADRA1B、 ADRA1D 是α1 型肾上腺素能受体的3 种亚型, 在交感神经传递, 肝脏代谢的调节, 血管张力的控制, 心脏收缩过程中发挥了重要作用； CHRM5 为胆碱能受体, 被激活后会导致多巴胺释放[15]； 程茹等[16-17]发现, 血管内皮受损后血小板活化, 并释放5-羟色胺等血管活性物质, 其中5-羟色胺作用于血小板表面的5-羟色胺2 A 受体, 促进血小板聚集活化及血栓形成, 由于高血压患者易形成血栓, 故左金丸调控HTR2A 时可间接影响高血压病程。

靶点类型归属和GO 生物过程分析显示, 左金丸治疗高血压涉及受体、 氧化还原酶、 转移酶、 转录因子、 水解酶、 分子伴侣等多种物质, 与腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号通路、 细胞-细胞信号传导、 平滑肌收缩、 去甲肾上腺素-肾上腺素血管收缩等生物过程相关。 KEGG 通路富集结果表明, 左金丸关键靶点基因富集在与高血压密切相关的信号通路上, 如cGMP-PKG 信号通路、 钙信号通路、 神经活性配体-受体相互作用、 唾液分泌、 心肌细胞中的肾上腺素能信号传导、 调节脂肪细胞中的脂肪分解、VEGF 信号通路等通路。 王晓华等[18]报道, 大多数组织中cGMP-PKG 信号通路可调节血管平滑肌细胞收缩和舒张,抗高血压。 抗心肌肥大, 抗动脉粥样硬化, 抗血管损伤/再狭窄。 另外, 钙离子信号通路控制新陈代谢、 分泌、 平滑肌收缩、 增殖等多种过程[19], 左金丸可能通过调节平滑肌收缩来发挥药效, 与GO 生物过程中平滑肌的收缩相佐证。

神经活性配体-受体相互作用通路是质膜上所有与细胞内外信号通路相关的受体和配体的集合, 调节生理节律、内分泌、 情绪、 学习、 记忆等, 而内分泌失调是引起高血压的常见原因[20]。 左金丸可通过唾液分泌来间接调控高血压, 它是维持口腔正常生理功能所必需的, 腺泡上皮细胞内的Ca2+浓度对其造成影响[21], 同时Ca2+也参与钙信号通路, 再次表明各通路复杂交互, 协同发挥作用。 赵璐等[22]调查研究发现, 不良生活方式导致的肥胖是高血压发病的重要因素, 而脂肪分解有利于达到降压效果； 陈明等[23]报道, VEGF 信号通路与高血压发生有着直接关系, 当高血压患者内皮功能受损后血压明显增高, 上述结果与本研究基本一致, 表明不同信号通路之间存在一定联系, 共同调节人体机能, 体现了中药多成分-多靶点-多途径的作用特点。

综上所述, 本研究从网络药理学角度揭示了左金丸治疗高血压的可能分子机制, 为该制剂进一步药效物质基础分析和机制考察提供了依据, 同时也使后续研究更有针对性。