流式细胞术建立甘肃地区学龄前汉族儿童外周血淋巴细胞亚群相对计数的正常参考值范围

王文第 毛宝宏 王晶晶 刘月芬 王 剑 王燕侠

淋巴细胞是人体免疫系统的重要构成部分。许多免疫相关的儿科疾病的诊断与治疗都涉及淋巴细胞亚群的检测。但是，目前国际上尚无儿童淋巴细胞亚群参考区间的统一标准，国内多数实验室均采用国外试剂说明书或国外参考文献提供的参考范围出具报告单[1,2]。许多研究表明，淋巴细胞亚群的参考值与被检测者的年龄、性别、民族和地区等因素相关[3-7]。因此，使用国外的淋巴细胞亚群参考值范围对我国儿童疾病状态下的免疫功能进行评估，可能造成一定偏差，有必要建立本地儿童分年龄段和性别相应的参考范围。本研究旨在通过流式细胞术建立甘肃地区学龄前健康儿童淋巴细胞亚群的正常参考范围，为临床诊断提供参考依据。

1 方法

1.1 伦理 本研究经甘肃省妇幼保健院(我院)伦理委员会审核通过(2017院伦审研第14号)。

1.2 纳入标准 ①2018年1月31日至2019年1月30日在我院行鞘膜积液、疝、血管瘤等手术(疾病类型均对机体免疫功能影响不大)或常规体检的0～7岁汉族健康儿童；②家长同意参加本研究并签署知情同意书。

1.3 排除和剔除标准 ①患心脑血管疾病：通过病史描述(如是否有头痛、头晕、心悸、气短、无力等症状)判断。②血常规异常：通过血常规报告判断。③肝、肾功能异常：手术患儿通过肝、肾功能检查报告判断；健康体检儿童部分有肝、肾功能报告，部分通过门诊医师工作站中的病史描述判断。④在进行淋巴细胞亚群检测的3周内存在感染：通过病史描述和血常规WBC判断。⑤有先天性免疫缺陷疾病：根据淋巴细胞亚群检测结果，剔除淋巴细胞亚群明显异常及不符合公式T%+B%+NK%=100%±5%和Th%+Ts%=T%±5%的样本。

1.4 年龄分组 参考文献[8]，分为新生儿组、婴儿组、幼儿组和学龄前组。

1.5 淋巴细胞亚群检测方法 手术患儿在术前检查或术后复查时采集血液样本，体检儿童在体检时采集血液样本。采静脉血2 mL(EDTA抗凝)，于24 h内完成检测。 采用四色免洗试剂MultiTestTMIMK Kit和FACSCalibur流式细胞仪(均为美国BD公司产品)，按照试剂说明书进行检测。每个全血标本标记2支流式细胞仪专用试管，分别加入20 μL MultiTest CD3 FITC/CD8 PE/CD45 PerCP/CD4 APC和20 μL MultiTest CD3 FITC/CD16+CD56 PE/CD45 PerCP/CD19 APC于试管底部；将100 μL EDTA-K2抗凝全血加入各管底部，充分震荡混合，避光孵育30 min；向各管中加入500 μL MultiTest溶血素(1×)，震荡混匀后室温避光孵育15 min；加入PBS 1 mL，离心5 min，弃上清；加入PBS 500 μL，混匀后上机。使用MultiSET软件自动获取淋巴细胞亚群相对计数结果。

1.6 质量控制 ①我院实验室使用的流式细胞仪通过国家卫健委临床检验中心室间质量评价；②每次样品检测前使用BD公司专用四色荧光校准微球进行仪器校准；③所有检测由同一位检验师完成，数据分析由王文第和毛宝宏共同完成。

1.7 统计学方法 非正态分布变量，用百分位数法(P2.5、P50、P97.5)获得正常参考值的范围，多组间比较用Kruskal-Wallis秩和检验，两组比较用Wilcoxon秩和检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 图1显示，研究对象筛选流程，792名0～7岁汉族儿童进入本文分析，男472名，女320名，新生儿组174名、婴儿组216名、幼儿组170名、学龄前组232名，来源手术人群623例，健康体检人群169例(表1)。

图1 研究对象筛选流程图

表1 792名甘肃汉族儿童的一般情况

2.2 外周血淋巴细胞亚群在不同性别、不同年龄组儿童之间的比较 表2显示，①不同性别之间比较，新生儿组CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞百分比和CD4+/CD8+比值差异有统计学意义，婴儿组CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞百分比和CD4+/CD8+比值差异有统计学意义；学龄前组T细胞、CD4+T细胞、B细胞、NK细胞百分比差异有统计学意义；②男、女各年龄组组间整体比较，T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞和NK细胞百分比，CD4+/CD8+差异均有统计学意义(表2)。

表2 792名甘肃省汉族儿童外周血淋巴细胞亚群分布[中位数(P2.5，P97.5)]

2.3 外周血淋巴细胞亚群在各年龄组的分布趋势 图2显示，随着年龄的增加，男女儿童淋巴细胞亚群百分比整体的变化趋势不同。T细胞、CD4+T细胞百分比随年龄增长呈降低趋势，男女童降低趋势相近；CD8+T细胞百分比随年龄增长呈升高趋势，女童更明显；B细胞百分比在1岁前呈上升趋势，之后呈降低趋势，女童的变化趋势较为缓和；NK细胞百分比的变化与B细胞相反，在1岁内降低，而后升高，男童变化趋势更明显。

图2 男女儿童各年龄组淋巴细胞亚群百分比变化趋势

3 讨论

国内外对于健康成年人淋巴细胞亚群的研究表明，淋巴细胞亚群检测结果存在年龄、性别、民族和地域的差异[1,14,15]。由于儿童的免疫系统是逐渐成熟的过程，淋巴细胞亚群计数在儿童不同生长发育阶段会表现出一定的差异[16]。

本研究结果显示，各年龄段多项淋巴细胞亚群指标存在性别差异。这与肖婧等[6]研究中592名中国汉族健康儿童(28 d至12 岁)外周血淋巴细胞亚群的分布特点类似。本研究CD4+、B细胞百分比在各年龄组间均女童高于男童，与林珊等[5]研究结果相反。淋巴细胞亚群在男女性别间产生差异可能是由于基因遗传和内分泌的不同导致不同性别可在童年时期形成不同的免疫力。本研究男女儿童各年龄组间分析显示，总体上所有淋巴细胞亚群在各年龄组之间的差异有统计学意义，男女儿童淋巴细胞亚群在多个年龄组两两比较差异均有统计学意义，这与林珊等[5]、肖婧等[6]研究结果一致；新生儿组T细胞、CD4+百分比及CD4+/CD8+比值明显高于其他组，与林珊等[5]的研究结果一致；且新生儿期以后各年龄段T细胞百分比相对稳定，与Kam等[12]和肖婧等[6]的研究结果一致。由于新生儿自身免疫功能尚未发育完全的生理特点，本研究分析了174例新生儿的淋巴细胞亚群百分比，与肖婧等[6]的研究不同。本研究发现，CD4+T细胞、CD4+/CD8+比值随年龄增长呈降低趋势，CD8+T细胞随年龄增长呈升高趋势，与大多数国内外研究一致；B细胞在1岁前升高，而后降低，NK细胞变化趋势恰好与B细胞相反，这与Kam等[12]和林珊等[5]的研究结果一致。

图3显示，本文结果与美洲[1]、欧洲[10]、非洲[11]和中国香港[12]比较儿童淋巴细胞亚群百分比、随年龄段的变化趋势基本一致，数值存在一定差异。与美洲[1]、欧洲[10]和非洲[11]儿童相比，甘肃汉族儿童T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞百分比较高，B细胞百分比较低，表明种族影响淋巴细胞亚群分布。与中国香港[12]儿童相比，甘肃地区的汉族儿童CD4+T细胞百分比较高，CD8+T细胞和NK细胞百分比较低，显示同一国家不同区域的淋巴细胞亚群亦存在差异，这可能与环境和生活习惯等因素有关。

图3 不同人群淋巴细胞亚群百分比随年龄增长变化趋势

注 w：周；m：月；y：岁

因此，不同地区应建立各自各年龄组及性别组的参考值。但是，由于儿童志愿者的招募及标本采集较为困难，使用流式细胞术来确定参考范围需要较大的成本消耗，使得我国对健康儿童不同年龄段以及不同性别的外周血淋巴细胞亚群的研究较少，只有少数的实验室建立了参考值[6,15,17，19]，绝大多数实验室都通过国外的有关文献以及试剂说明书来确定其参考范围，这些参考值可能并不适合我国不同省份儿童。另外，本研究检测了174例新生儿血样标本分析淋巴细胞亚群，检测数据可为新生儿淋巴细胞亚群百分比的评估提供参考。文献[20]指出，淋巴细胞亚群结果应首先根据下述公式进行评估：T细胞(%)+B细胞(%)+NK细胞(%)=100%；CD4+T细胞(%)+CD8+T细胞(%)=T细胞(%)。本研究所得出参考值的中位数符合上述公式，证实了研究结果符合各淋巴细胞亚群保持一定比例的规律。

本研究的不足：确定医学参考值范围的样本量如果性别间可能有差别，不同性别的样本量应至少达到100例，本文女生组中样本量不足。