晋东南3种道地药材植物根际真菌群落特性

李毳，刘怡

山西财经大学资源环境学院，山西 太原 030006

微生物群落的结构、功能和多样性受多种因素的影响，目前尚无一致的结论（柴永福等，2016）。研究表明环境选择和扩散限制是影响微生物群落构建的两个重要方面，二者相对作用的大小因生物属性、生境和研究尺度不同而存在差异（牛克昌等，2009）。植物根际土壤中生长着大量各种类型的微生物，包括细菌、真菌、放线菌等（厉桂香等，2018）。植物和土壤因子对根际微生物群落的结构和多样性具有重要的影响。根系分泌物介导了植物根际微生态系统的物质和能量驱动微生物趋化过程，形成了植物所特有的根系核心微生物区系（Bulgarelli et al.，2012）。根系分泌物影响根际微生物的种类和数量，并对微生物的生长繁殖及代谢过程产生影响（Singh et al.，2004），植物通过根际“主动”选择土壤微生物，尽管不能确定是否选择了有益的微生物（Chaudhary et al.，2016），但这些微生物通过促进植物对矿质营养物质的吸收、改善土壤的理化性质，从而促进植物生长（Bais et al.，2004）。中药材植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bge）、地黄（Rehmannia glutinosa）等的酸性根系分泌物可以诱导厚垣孢子、卵孢子和菌核的萌发，影响土壤微生物的群落组成，细菌数量减少，真菌数量增加（严铸云等，2012）。有多项研究表明，药用植物能够显著影响其根际微生物种群的组成（Berendsen et al.，2012），长期种植地黄能够显著改变土壤微生物群落的结构和多样性（吴林坤等，2015）。Glassman et al.（2017）的研究发现pH和土壤营养在局域尺度上驱动真菌的群落的构建，真菌群落结构和土壤理化性质显著正相关。在研究植物群落构建的驱动力时，植物-微生物-土壤之间的相互作用很容易被忽视（Thompson et al.，2001），土壤理化因子与植物类型是否相互作用，影响土壤微生物多样性还有待深入研究。

山西地形复杂，晋东南太行山区是传统中药材产区，中药材资源丰富且历史悠久，大宗中药材道地品种连翘（Forsythia suspensa）、远志（Polygala tenuifolia Willd）、黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）、黄芪（Astragalus membranaceus Fisch）、柴胡（Bupleurum chinese）、党参（Codonopsis piloula）等都在全国形成规模。本研究中选取远志、柴胡、党参3种野生道地药材为研究对象，小尺度局域空间上探讨 3种药材根际土壤真菌群落多样性、结构及其驱动因素。

1 研究区域与研究方法

1.1样品采集

2018年5月，在山西省长治市武乡县石圪垤村（36°44′N，113°60′E）附近沟坡，选取地表植被基本均匀的样地，选择长势、株龄（5年左右）相近的野生远志、柴胡和党参各3株，共收集到9个样品的根际土壤。具体方法参照Riley et al.（1969，1970）的抖落法：挖取具有完整根系的土体，轻轻抖落大块不含根系的土壤，然后用力将根系表面附着的土壤全部抖落下来，混合后，密封于无菌塑料袋，置于车载冰箱保存，并尽快带回实验室。仔细去除新鲜土样中可见的植物残体及土壤动物等，将土样分为两份，一份风干处理，用于土壤理化性质的测定，一份提取土壤微生物基因组DNA，用于高通量测序。

1.2土壤理化性质测定

土壤含水量用烘干法测定；土壤pH值用电位法HANNA HI3221测定（土水质量比1∶2.5）；土壤全碳（TC）、全氮（TN）、全硫（TS）用元素分析仪（vario MACRO cube，Germany）测定；土壤硝态氮（NO3--N）、亚硝态氮（NO2--N）、铵态氮（NH4+-N）用CleverChem 380间断元素分析仪测定；土壤粒度用粒度仪（Mastersizer 3000，Malvern，UK）测定，上机前对土壤进行前处理去除碳酸盐和有机质。

脲酶采用苯酚钠-次氯酸钠比色法，其活性以37 ℃下培养24 h 后1 g土壤产生的NH3+-N的mg数表示；蔗糖酶采用3, 5-二硝基水杨酸比色法，其活性以37 ℃培养24 h 后1 g土壤产生的葡萄糖的mg数表示；过氧化氢酶活性采用KMnO4滴定法，其活性以20 min内每克土壤分解的过氧化氢的mg数表示。

1.3土壤真菌群落分析

每种药材的土壤取3个样品，每个样品分别称取5 g，将鲜土样送至北京百迈客生物科技有限公司进行高通量测序。基于Illumina HiSeq测序平台，利用引物ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）和ITS2-Rev（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）对核糖体ITSⅠ高变区进行测序。

1.4数据分析

各样地土壤理化变量之间的显著性差异（P＜0.05）均采用单因素方差分析（SPSS 23.0 One-way analysis）和多重比较分析。使用FLASH v1.2.7软件，通过overlap对每个样品的reads进行拼接，得到的拼接序列即原始 Tags数据（Raw Tags）；使用Trimmomatic v0.33软件，对拼接得到的 Raw Tags进行过滤，得到高质量的 Tags数据（Clean Tags）；使用UCHIME v4.2软件，鉴定并去除嵌合体序列，得到最终有效数据（Effective Tags），使用QIIME（version 1.8.0）软件中的UCLUST[2]对 Tags在 97%的相似度水平下进行聚类、获得OTU。使用Mothur（version v.1.30）软件，计算样品的Alpha多样性指数，包括反映微生物多样性的Shannon指数、Simpson指数，群落丰富度指数Chao1指数和 ACE指数以及反映测序深度的Coverage指数。

2 结果与分析

2.1土壤理化性质

土壤pH、TC、TS、土壤粒度、脲酶和蔗糖酶活性在3种不同植物的根际土间差异显著，而土壤含水率、TN、NO3--N、NH4+-N、NO2--N、过氧化氢酶活性的差异不显著（表 1）。所有土壤样品的pH都大于7，为弱碱性土壤。党参根际土的pH值最大（7.80）。TN、TC、TS在柴胡根际土中均为最大。土壤脲酶和蔗糖酶在样品间差异显著，柴胡根际土中的脲酶活性最高（6.54），蔗糖酶活性最低（8.64），党参根际土中脲酶活性最低（0.55），蔗糖酶活性最高（11.40）。

2.2 3种药材根际土壤真菌群落组成及其多样性

图1 不同植物根际真菌群落在门（a）和属（b）水平的相对丰度及聚类分析（c）Fig. 1 The relative abundance of dominant fungal phylum (a) and genus(b), and cluster analysis(c) from rhizosphere of three plants

3种药用植物的9个根际土壤样品中共鉴定出9个真菌门和143个真菌属，真菌群落分布格局具有一定规律性（图1a），子囊菌门Ascomycota和担子菌门 Basidiomycota相对丰度最大，党参根际土壤中，担子菌门的相对丰度显著大于远志和柴胡，而子囊菌门的相对丰度显著小于远志和柴胡。从9个样品根际土壤群落中，共鉴定出相对丰度大于1%的优势真菌属有9个，其中，丝盖伞属Inocybe（39.89%）、白环蘑属Leucoagaricus（7.05%）在党参根际真菌群落中占据显著优势；被孢霉属Mortierella（3.39%、8.34%、3.96%）分别在远志、党参和柴胡根际中均占有显著优势；Ramicandelaber属（1.02%，3.79%）、Paraphoma属（1.98%、1.60%）分别在远志和柴胡根际真菌群落中优势较大；Naganishia属（4.77%）在远志根际群落中优势较大；Tetracladium属（1.05%、2.64%）在党参和柴胡根际土中优势较大；Ceratobasidium属（1.96%）在柴胡根际土中优势较大（图1b）。根际真菌属水平丰度热图分析结果显示（图1c），远志、柴胡和党参根际真菌群落结构差异显著，党参与远志、柴胡差异更大。

3种药材植物根际土壤真菌群落α多样性分析结果见表2。其中柴胡根际真菌群落Shannon指数最大，Simpson指数最小，因此，柴胡根际真菌群落多样性最高，而均匀度较低。党参的Shannon指数最小，Simpson指数最大，说明党参根际真菌群落的多样性较低，而均匀度较高。远志的 ACE指数和Chao1指数最大，表明其根际真菌群落中种类数目最多；党参根际真菌群落的ACE和Chao1指数最低。

表2 3种药材根际土壤真菌群落多样性Table 2 Diversity of fungal communities of three species rhizosphere

2.3环境因子对土壤真菌群落α多样性的影响

土壤环境因子和α多样性指数间的相关分析结果表明（图2），根际真菌群落Simpson指数与根际土壤pH、蔗糖酶呈显著负相关；Shannon指数与pH、蔗糖酶呈显著负相关，与TN、TS和脲酶呈显著正相关性。说明3种植物根际真菌群落的多样性与土壤环境因子密切相关。

2.4环境因子与植物类型对土壤真菌群落的关系

NMDS分析结果表明3种药用植物根际土壤真菌群落组成差异显著（P＜0.05）（图3a）。为了探究3种植物根际土壤真菌群落差异的驱动因素，对本研究区土壤中的优势真菌属丰度和土壤理化因子、植物类型进行冗余分析（图 3b），结果表明RDA1和RDA2分别解释3种植物根际土壤真菌群落差异的44.41%和20.54%，其中土壤pH、蔗糖酶、脲酶、全氮对真菌群落结构影响显著，且土壤 pH是解释度最高的环境因子。

在植物分类学上，3种药用植物分属于远志科（Polygalaceae）、伞形科（Umbelliferae）和桔梗科（Campanulaceae），植物的生理生态特征具有一定的差异。方差分解分析植物在科水平上的差异与土壤因子对植物根际微生物群落影响的相对大小（图4），结果显示土壤、植物种类分别解释了3种植物根际真菌群落差异的32%和27%，环境因子和植物类型的交互作用对其解释为6%。表明土壤环境因子和植物类型对根际真菌群落均具有显著的影响。

图2 α多样性指数与土壤环境因子相关性矩阵图Fig. 2 Correlation matrix diagram among α-diversity index and edaphic factors

图3 优势真菌属的NMDS分析及其与土壤环境因子和植物类型的冗余分析Fig. 3 NMDS analysis of dominant fungi genus (a) and RDA analysis of dominant fungi genus constrained by edaphic factor (b)

图4 方差分解分析土壤环境因子和植物类型对真菌群落影响相对大小Fig. 4 Variation partitioning analysis showing the percentages of variance in fungal communities explained by soil environment factor and medicine plant type

3 讨论

3.1土壤环境因子对植物根际真菌群落的影响

微生物作为土壤地球物质化学循环的主要参与者，其群落结构和功能受到土壤环境因子的影响。环境因子和扩散限制对于微生物群落结构和多样性的影响作用的相对大小，因微生物属性（细菌、真菌、原生动物）、生境类型、研究尺度的不同而不同。就环境因子而言，不同的土壤因子（pH、盐度、温度、湿度、土壤酶等）与微生物群落结构和多样性的关系不尽一致。Burns et al.（2015）在美国博德加湾附近研究了 14种不同植被类型的土壤微生物群落多样性，发现在局域尺度下，植物种、土壤化学特征和空间因素对土壤真菌和细菌群落的多样性均具有显著的影响。对华北落叶松林土壤真菌群落结构的研究显示，土壤理化因子和地上植被多样性对真菌群落结构和多样性具有显著影响，而且在测定的 10种土壤因子中，不同的真菌门与各种土壤理化因子（铵态氮、硝态氮和盐度）的相关性存在差异（赵鹏宇等，2018）。王淼等（2013）在罕山通过研究不同林型下土壤微生物特性时，发现土壤有机质和土壤含水率对真菌群落结构和代谢多样性的贡献率很高。Cox et al.（2010）的研究表明生态系统中真菌群落的分布与土壤氮的含量密切相关。本研究在微尺度上分析了3种药用植物根际真菌群落的结构，结果显示土壤 TN、pH、脲酶及蔗糖酶对真菌群落有显著影响。本研究中植物根际子囊菌门和担子菌门相对丰度较高，它们不仅是土壤真菌群落中有机质的主要分解者（Yelle et al.，2010），而且二者与植物共生形成菌根，参与根际氮素的循环，对植物的生长发育具有重要作用。许多研究结果都表明，土壤菌根菌（丛枝菌根真菌、外生菌根菌）与土壤pH的显著相关（Kluber et al.，2012），与本研究结果一致。

3.2植物物种类型与根际土壤微生物的相关性

植物类型对根际土壤微生物群落的“选择”主要是通过植物根系分泌物来实现的（Singh et al.，2004），特别是菌根真菌类等与植物共生的微生物，是根际微生物群落的主要组成物种。根系分泌物是植物与土壤进行物质交换和信息传递的重要载体物质，是植物响应外界胁迫的重要途径，也是构成不同植物微生态结构的关键因素（Bais et al.，2006）。根系分泌物为微生物提供碳源，驱动土壤微生物营养循环（N、S、P）过程（刘纯等，2013）。根系分泌物的种类和数量决定了根际微生物的多样性和丰度，并对微生物的生长繁殖及代谢过程产生影响（袁秀梅等，2016；Hu et al.，2018）。药用植物根际分泌物中丰富的糖类、氨基酸及维生素等对土壤微生物的种类、数量及植物根际的分布具有显著的影响（Chaudhary et al.，2016）。不同药用植物可以通过根系分泌物作用于根围环境，产生根际效应，影响根际土壤微生物的群落多样性和结构。

在本研究中，土壤环境因子和植物是植物根际真菌群落结构和多样性的主要驱动因子，土壤-植物-微生物相互作用，土壤为植物和微生物提供载体和矿质营养，植物为土壤提供碳源和有机质，微生物驱动碳、氮、硫、磷等物质化学循环过程。土壤、植物、微生物相互作用，形成特定的土壤生态系统，为“道地”药材的生长提供了特异的生境。道地药材的形成有其历史条件、地理条件和生长的环境因子，“道”的形成就是不同的药材基因型和环境因子互相作用的产物。山西太行山地区自古以来就是党参、柴胡以及远志的重要产区，野生党参、柴胡、远志的生长也表明环境因子起到了重要的作用。

4结论

柴胡、党参和远志3种野生道地药材根际真菌群落主要受土壤环境因子和植物类型的影响，且土壤环境因子是根际土壤微生物群落结构和多样性的主要驱动因素，同时，植物类型也发挥重要作用，体现了植物-土壤-微生物在土壤生态系统中的协同关系，为道地中药材的生长提供了特定的生境。