不同解冻温度对细管冻精精子活力的影响

陈玉萌

摘 要 寻找肉牛精子最佳解冻温度的影响。温度是精子最敏感的外界因素之一。实践证明，牛精液冷冻效果好坏与解冻温度有很大关系。牛冷冻精液质量的好坏，直接影响受胎率，影响着养殖户的经济效益。而冻后精子活力及生存时间（解冻后37℃保存4小时精子活力）又是冷冻精液质量中最重要的两项指标。为此，可以通过本试验了解不同解冻温度对牛冷冻精子复苏的影响，找出适宜牛细管冷冻精液的最佳解冻温度。目的是寻找最佳的解冻温度及解冻时间，从而提高精子冻后活力，提高受胎率。在生产实践中根据具体情况选用适合的解冻温度和解冻时间。

关键词 肉牛；冷冻精液；解冻温度；精液质量

牛、羊精液冷冻保存技术研究主要开始于20世纪50年代，Polge[1]等用甘油作冷冻保护剂，在-79℃保存牛精液并用于输精，于1951年产下世界上第一头冷冻精液牛犊。目前，养牛业中已广泛应用冷冻精液人工授精[2]，该技术极大地促进了牛生产性能的改进和新品种的培育。我国牛的冷冻精液剂型除颗粒冻精外，还有细管冻精。细管冻精有很多优点，冷冻时受温比较均匀，冷冻效果好，精液利用率高，值得推广，大大提高了受胎率，可以培育出体格健壮、遗传性能优越的犊牛。优势不受地区、季节、公牛年龄的限制，运输方便，细管冻精有效保存时间长，对进行牛冷冻精液的解冻方法的优化研究具有重要的现实意义。

1 材料与方法

1.1 供试冻精的选择

购于吉林市繁殖改良站的肉牛细管型冷冻精液提供的0.5毫升。

1.2 解冻用具

专用的消毒杯、温度表、自备的凉开水、电炉、温度计试验时这些用具随身携带。

1.3 方法

在温水解冻范围内设计五个温度区：38℃、38.5℃、39℃、39.5℃、40℃。设定解冻时间为10s、20s、30s三个档。解冻后，通过光学显微镜在400- 600倍条件下，室温20℃情况下，检查解冻后精液的活力。每个温度区和解冻时间档设三个重复。

1.4 解冻

将细管完全淹没盛有温水的容器，将水温调节至需要的温度后，用镊子从液氮罐中迅速抽取一支细管冻精，轻轻抖动，把带出的液氮抖掉，立即将其放入准备好的温水中并轻轻摇晃，一定时间后把细管取出擦掉管外水滴，剪去封口端挤一滴于载玻片上，迅速放到显微镜下观察精子活力。

1.5 不同保存温度下的精子活力

检查完解冻时的精子活力后，将同一头份的个样品混合然后将混合的精浪分为两等份用灭菌的玻璃纸封好小试管，分别放在两个试管架上，然后将二个试管架同时分别放在37℃恒温培养箱内和5-8℃冰箱中保存。在37℃恒温箱内保存的每隔4小时检查活力一次，5-8℃保存的每隔招小时检查一次活力。48小时后改为每隔24小时检查一次活力，直至10小时为止。

2 试验结果

2.1 解冻温度对细管冻精精子活率的影响

注：解冻温度精子活力之间差异不显著（P>0.05），解冻的精子活力差异极显著（P<0.01）。

2.2 解冻时间及温度对精子活力的影响

由表1可知： 分别应用38.0℃、38.5℃、39.0℃、39.5℃、40.0℃进行解冻：10s、20s两个时间的解冻精子活力差异不显著，而30s的解冻与10s、20s的解冻精子活力差异显著。从表中可以看出，同一解冻时间下解冻温度不同，精子活力也不同。10s解冻时：38.0℃解冻精子活力最低，38.0℃、38.5℃ 解冻精子活力与39.0℃、39.5℃、40℃解冻精子活力差异显著，而39.0℃、39.5、40℃解冻精子活力差异不显著；20s解冻时：38.0℃解冻精子活力最低，与38.5℃、39.0℃、39.5℃、40℃解冻精子活力差异显著，而38.5℃、39.0℃、39.5℃、40.0℃解冻精子活力之间差异不显著；30s解冻时：39.5℃解冻精子活力最高，与38.0℃、38.5℃、39℃、40℃解冻精子活力差异极显著。

2.3 综合分析

用39.5℃温水解冻30s精子的活力最高，冷冻精液解冻后精子活力达0.53。用39.0℃温水解30s精子的活力也较高，冷冻精液解冻后精子活力达0.47。其他温度解冻后精子活力较低。

3 结论

3.1 讨论

目前，英、法、日等国家采用低温（5℃）缓慢解冻，新西蘭、芬兰、瑞典、澳大利亚使用室温（15℃）中速解冻，匈牙利、比利时、前苏联等20多个国家采用37-40℃快速解冻，挪威等国采用75℃均取得了良好的效果。但就世界范围而言，大都倾向于采用35-40℃解冻。该实验表明，在接近体温（40℃）下解冻效果较好，解冻温度39.5℃、30s解冻较好，保存时间较长，适合解冻后长时间保存后输精；造成世界范围内解冻温度不一致，可能主要是由于牛品种的特异性及精子膜对冷冻解冻温度骤变的敏感性不同，膜受损伤的程度及精子的畸形率也不同，从而精子细胞表现出不同的活率。

3.2 结论

采用解冻温度39.5℃、30s解冻的冷冻精液的活力的最好的，精子活力及生存时间这两项指标都比较好。在生产实践中对细管冻精进行解冻时，可根据具体情况选用适合的解冻温度和解冻时间。根据本实验结果建议采用解冻温度39.5℃、解冻时间30s。

参考文献：

[1] POLGE C， ROESON L E A. Fertilizing capacity of bull spermatozoa after freezing at-79℃[J].Nature，1952，169：626.

[2]胡建宏，王立强，李青旺.小尾寒羊精液冷冻温度曲线初步研究[J].西北农林科技大学学报：自然科学版，2002，30（l）：85-88.