不同Roux肠袢长度的十二指肠空肠旁路术对2型糖尿病模型大鼠糖代谢的影响

洪智，黄鹤，张起维，王宇，汤振，曾超

（皖南医学院弋矶山医院胃肠外科，安徽 芜湖 241001）

21世纪，糖尿病成为了世界性公共健康问题。根据2017年中国2型糖尿病防治指南：全球约有4.25亿糖尿病患者（2017年），我国成年糖尿病患病率亦从1986年的1.04%升高到2013年的10.4%，我国约有1.18亿糖尿病患者，占全球的27%，居全球首位，其中又以2型糖尿病患者为主［1］。有研究表明中国2型糖尿病占糖尿病人群的93.7%［2］。在2010年后已经有超过9 240万的成人糖尿病患者和1.482亿人次的前驱糖尿病患者［1，3］。对于肥胖合并2型糖尿病患者，减肥手术在有效改善肥胖的同时能很好地降低血糖，尤其是Roux-en-Y胃转流术（RYGB）［4］。故自2016年国际糖尿病组织联合申明将代谢手术也作为治疗2型糖尿病的措施之一［5］。但对于代谢手术，尤其RYGB具体机制仍旧不是很清楚。有研究认为其改善血糖与体重减轻有关［6］，但也有研究认为体重减轻并非其主要原因［7］，而是与术后胃肠激素变化有重要关系［8］，为此Rubino等［9］开发出了十二指肠-空肠旁路术（duodenal-jejunal bypass，DJB），一种专注于肠道功能的RYGB保胃手术，用于阐明手术后血糖控制的相关机制。本实验在此基础上主要探究不同Roux肠袢长度对空腹血糖（FPG）及胰高血糖素样肽（GLP-1）的影响，以及阐明其改善血糖的可能机制，从而来改进RYGB术式以期达到最佳手术效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 40只清洁级雄性2型糖尿病模型（Goto-Kakizaki，GK）大鼠，8周龄，体重（245±15）g，术前空腹血糖均大于7.0 mmol/L，购于上海斯莱克动物实验有限公司，实验动物许可证号SCXK（沪）2017-0005，均饲养于南京医科大学无菌动物实验房。采用抽签法先将40只GK大鼠随机分成5组，每组8只，分别为：对照组A组：离断胃十二指肠处重新缝合组；手术组B～E组：保留Roux肠袢分别为10、20、30、40 cm的DJB组。

1.2 手术方法

1.2.1 术前准备 术前将GK大鼠饲养于无菌环境2周，采用12 h光照，12 h黑暗以及合适的温度和湿度饲养，按时喂食，饮水不断。在术前禁食12～16 h，予以5%葡萄糖氯化钠液供大鼠饮用，术前2 h禁止饮水。术前予以1%戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉，按1 ml/kg给药，若大鼠术中苏醒，可再次予以首次剂量的10%～15%。麻醉成功后进行备皮消毒铺巾。

1.2.2 手术过程 将十二指肠与胃幽门部连接处离断后重新缝合作为对照组A组；对于手术组则按照保留胃部的Roux-en-Y术式进行，离断后的十二指肠残端用0号细线进行间断缝合；找到屈氏韧带，于后延伸15 cm处离断，再用远端小肠于胃离断端进行端端吻合（方法同前）；将近端小肠与距胃肠吻合口10、20、30、40 cm的Roux肠袢进行端侧吻合分别作为手术组B组、C组、D组、E组；术后检查各缝合处无出血渗血等关闭腹腔，完成手术。见图1。

图1 对照组和保留不同长度Roux肠袢DJB手术组

1.2.3 术后管理 术后对GK大鼠保暖保温。每隔15 min观察并变换大鼠体位一次，直至大鼠可活动。大鼠术后前3 d均予以5%葡萄糖氯化钠液，3～4 d后改普通饲料喂养；术后第1天给予20万U青霉素肌注，连续3 d。术后按时更换新垫料。

1.3 检测指标和方法

1.3.1 检测体重 分别于术前3 d，术后1、3、5、8周用电子天平动态测量5组GK大鼠的体重。

1.3.2 测定FPG及GLP-1 分别于术前3 d及术后1、3、5、8周取大鼠眼眶后静脉血，采用血糖仪测定大鼠FPG水平；采用ELISA法检测血清GLP-1，试剂盒购于武汉基因美科技有限公司。1.3.3 免疫组化分析（SP法） 术后8周从各组大鼠获取胃肠吻合处、十二指肠残端的屈氏韧带处及共同通路空肠处的组织标本（图1中①②③），制备石蜡切片，采用SP法，抗体采用兔抗大鼠GCG（GLP-1）多克隆抗体（南京爱贝生物科技公司），SP免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒购于南京建成技术有限公司，严格按照说明进行操作。并对统计结果OD值进行分析。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用重复测量方差分析，组间比较采用LSD法，组内比较采用Dunnettt检验，其他两组之间比较则采用两独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GK大鼠的手术成功率及术后存活情况 以临床围手术期为大致标准，一般胃肠手术7～10 d出院，本研究定义在术中及术后1周之内为手术成功率。5组40只大鼠的手术成功率为72.5%，但在8周这段时间总存活率为60%。其中DJB手术组B、D、E组术后各死亡3只，C组术后死亡2只，但在随后E组相继死亡，对照组和其它手术组存活大鼠存活良好。

2.2 体重变化 术前各组GK大鼠的体重差异无统计学意义（P＞0.05）；术后1周时，对照组与手术组均有所下降且对照组A和手术组C、D、E组和本组术前比较差异有统计学意义（P＜0.05），但各组之间差异无统计学意义（P＞0.05）；各组术前与术后5、8周比较差异无统计学意义；术后5、8周剩余手术组与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 对照组与不同Roux肠袢长度DJB手术组GK大鼠术前和术后的体重变化（g，±s）

表1 对照组与不同Roux肠袢长度DJB手术组GK大鼠术前和术后的体重变化（g，±s）

注：术后1周B、D、E组术后各死亡3只，C组术后死亡2只；术后3～5周E组又死亡3只，剩余2只未做统计学分析。与术前比较，1）P＜0.05

组别对照组A组手术组B组手术组C组手术组D组手术组E组整体分析F，P组间比较时间比较组间*时间术前3 d 243.18±6.52 236.86±5.06 245.68±11.20 237.56±4.52 242.54±7.43术后1周229.94±7.841）216.12±28.38 217.73±2.901）212.46±6.601）215.38±4.981）术后3周237.79±10.03 227.96±7.70 229.58±5.171）227.90±5.75 229.04±5.161）术后5周245.55±10.07 241.66±6.79 242.02±6.73 237.36±4.79—术后8周252.30±9.20 247.60±5.94 252.17±8.25 244.88±9.14—球形检验校正HF系数：0.538 2.871、0.062 52.903、0.000 0.908、0.504

2.3 FPG水平的变化 术前各组GK大鼠的FPG水平差异无统计学意义（P＞0.05）。对照组术后1、3周较术前有所下降（P＜0.05），但术后5、8周差异无统计学意义（P＞0.05）；各DJB手术组术后1、3、5、8周与术前比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；手术组与对照组术后同一时间点FPG比较差异均有统计学意义，手术组D、E组较B、C组差异有统计学意义（P＜0.05），保留Roux肠袢较长的手术组E组降低血糖的效果更好。见表2。

2.4 GLP-1水平的变化 术前各组GK大鼠的GLP-1水平差异无统计学意义（P＞0.05）；对照组与DJB手术组术后均较术前GLP-1水平下降（P＜0.05）；各手术组术后同一时间点GLP-1水平与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；术后 1、3、5、8周手术组D、E组与手术组B、C组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；较长Roux肠袢的手术组，GLP-1降低越明显，以E组为最，与对照组A组差异最明显，但由于E组在第5周并无数据进行比较，不过D组与A、B、C组在术后5、8周GLP-1水平差异仍有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表2 对照组与不同Roux肠袢长度DJB手术组GK大鼠术前和术后FPG水平变化（mmol/L）

表3 对照组与不同Roux肠袢长度DJB手术组GK大鼠术前和术后空腹GLP-1水平变化（ng/L）

2.5 GLP-1受体表达情况 DJB手术组在胃肠吻合处、十二指肠残端屈氏韧带处及共同通路空肠处与对照组A组相比GLP-1受体表达明显增多（P＜0.05），且保留Roux肠袢较长的D组中GLP-1受体表达较多，与手术组B、C组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；但在十二指肠残端屈氏韧带处，手术组B、C、D与对照组A组相比却明显减少（P＜0.05）。见图2、表4。

表4 对照组与不同Roux肠袢长度DJB手术组GK大鼠术前与术后8周的GLP-1受体表达比较（OD，IOD/μm2）

3 讨论

糖尿病作为慢性病之一，已经成为威胁人类健康的全球性问题，而作为大多数的2型糖尿病患者通常合并肥胖等代谢异常。而RYGB手术为肥胖的2型糖尿病患者提供了更有效的治疗［10-12］。尽管许多研究已经说明了 RYGB手术的作用机制，但仍有很多问题需要回答。这促使我们开展工作，寻求更多有效RYGB的手术。DJB作为RYGB的保胃模型，已被证明可提供显著且持久的控制血糖、食物摄入量、体重或营养吸收［9，13］。根据 DJB 手术特点，它被认为是低体重指数（BMI）的2型糖尿病患者的有效代谢手术［14］。临床上，患有2型糖尿病的低BMI的患者用DJB治疗可以有效控制血糖［15-17］。此外，在肥胖和非肥胖2型糖尿病大鼠模型中进行DJB手术，如 GK［18］，ZDF［13，19］和高脂饮食联合链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠［20］已被证明能显著地改善血糖。但对于DJB术改善血糖的相关机制并未解释清楚，有研究发现，DJB通过增加胆汁酸和促进GLP-1分泌可以改善大鼠的胰岛素抵抗［21］。研究发现DJB手术能有效改善血糖但与对照组相比体重变化并无明显差异，其体重减轻并非降低血糖的主要因素，而是与胃肠激素的分泌相关，最主要的有GLP-1［22-23］。有相关研究表明增加GLP-1和GLP-1受体刺激可以改善葡萄糖耐量［22］。GLP-1主要分布于肠道的L细胞，故DJB手术的肠道解剖位置的改变可能是有效控制血糖的相关机制，但对于DJB术式的最佳方式现在仍无统一标准，故本实验主要探讨不同长度Roux肠袢的DJB术式对糖代谢的影响以及可能的机制。

图2 对照组与不同Roux肠袢长度DJB手术组在不同肠段处的GLP-1受体的表达（免疫组化×100）

本研究结果表明手术组与对照组在术后体重变化上无统计学意义，但FPG在术后明显改善，并且保留Roux肠袢较长组降低FPG的效果明显（P＜0.05）。血清空腹GLP-1水平测定结果表明各DJB手术组在术后1、3周与对照组相比均明显下降，并在各手术组间差异亦有统计学意义，其中以保留40 cm Roux肠袢的E组下降最明显（P＜0.01）。但手术组E组大鼠后期存活量不足无法比较。从GLP-1受体在胃肠吻合处、十二指肠残端屈氏韧带处、共同通路空肠处的免疫组化的结果可知，随着Roux肠袢的延长，在胃十二指肠连接处、共同通路空肠处GLP-1受体的表达明显增多，而在十二指肠残端屈氏韧带处GLP-1受体表达明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01）。表明食物刺激提前进入空肠可以上调GLP-1受体，而缺少食物刺激的十二指肠GLP-1受体下调，但也有可能与GLP-1受体本身在肠道的分布有关。故本实验说明较长Roux肠袢的DJB术能更有效地降低血糖，但体重变化不明显，其机制可能是食物刺激，GLP-1受体上调，提高了GLP-1的结合率，促使血糖下降，负反馈于GLP-1，进而使餐前GLP-1逐渐降低。但随着Roux肠袢延长，大鼠死亡率明显增多，手术风险增加。

本实验的不足之处手术组大鼠数量较少，结果可能存在偏差；本实验并未测定餐后GLP-1的分泌情况；手术组E组术后3周后缺少数据以及实验时间较短对于DJB术后的长期结果有何变化并不清楚；缺少术前GK大鼠GLP-1受体在肠段中的表达情况。故减肥手术改善血糖的具体机制还有待进一步探究，相信随着实验研究的深入，进一步了解其机制，选择更有效的手术方式将为2型糖尿病患者带来更多益处。