一种基于DPBF的单线态氧纳米探针

于印霄，王小卉，陈雪桥，刘元安

(北京邮电大学电子工程学院 安全生产智能监控北京市重点实验室，北京 100876)

1 引言

光动力疗法(Photodynamic therapy,PDT)是一种基于光敏药物吸光产生高活性氧(主要是单线态氧，1O2)、进而杀死肿瘤细胞的治疗方法[1-2]。在正常情况下，细胞内单线态氧水平很低，单线态氧的产生与清除处于动态平衡中，一旦打破平衡，将引起一系列生理反应，严重时将导致细胞死亡[3-4]。因此，有效地检测单线态氧浓度变化对于评估光动力治疗效果具有重要的意义。

目前常见的单线态氧检测方法主要有电子顺磁共振法(ESR)、直接测定法、分光光度法和荧光光度法等。ESR方法灵敏度高，选择性好，但测定的ESR信号受到共存离子、溶剂等条件的影响，检测误差较大，而且仪器的操作程序相对复杂；直接测定法对生物体无侵害，选择性高，但灵敏度低，检出信号弱，无法用于低浓度1O2的检测；分光光度法和荧光光度法选择性好，但大多探针水溶性较差，不利于生物体系内1O2的测定[5]。近年来，具有高灵敏度和良好水溶性的单线态氧探针在生物医学领域受到越来越多的关注。单线态氧荧光探针(Singlet oxygen sensor green,SOSG)具有较好的水溶性，可以间接测量1O2浓度[6-7]，但其自身在紫外光照下会产生1O2，且细胞吞噬效率较低，因此导致其在定量检测1O2和亚细胞水平应用方面存在一定的局限性[8-10]。1,3二苯基异苯并呋喃(DPBF)是一种常用的1O2指示剂[11]，能快速与1O2进行反应[12-13]，对少量1O2具有比SOSG更高的敏感性。Ping等[14]将DPBF包埋于纳米颗粒中，通过共聚焦显微镜对吞噬纳米颗粒的癌细胞进行荧光成像，根据荧光成像强度变化监测光动力治疗过程中细胞内单线态氧的变化。在光动力治疗领域，纳米探针正逐渐用于检测细胞内1O2[15]，通过生物兼容纳米颗粒负载非水溶性的单线态氧检测剂，可以拓展其在生物检测方面的应用。总之，我们需要发展更多新型、简便且灵敏度较高的水溶性单线态氧检测材料。

本文首先基于再沉淀法制备了二氧化硅包覆DPBF的单线态氧纳米探针。其中采用高分子材料聚苯乙烯(PS)和十二烷基三甲氧基硅烷(DTS)作为基质，DTS水解在纳米颗粒表面形成二氧化硅壳层，DPBF随机地分散于纳米颗粒内部，即形成包覆DPBF的纳米颗粒[16]。然后选择吲哚菁绿(ICG)作为光敏剂，采用808 nm激光辐照，通过观察纳米探针的吸收峰强度变化检测单线态氧的产生[17-19]。随着激光辐照剂量的增加，纳米探针的吸收峰逐渐被猝灭，表明该纳米探针对单线态氧具有高灵敏度，可以用来监测光动力治疗中的单线态氧浓度变化。

2 实验

2.1 材料与仪器

本实验中所需要的化学试剂：1,3 二苯基异苯并呋喃(DPBF)、聚苯乙烯(PS)、十二烷基三甲氧基硅烷、四氢呋喃(THF)均购自Sigma-Aldrich，吲哚菁绿(ICG)和二甲基亚砜(DMSO)购自百灵威科技有限公司，氨水购自国药集团化学试剂有限公司。以上所有试剂购买后配成溶液直接使用。在实验过程中均用18 MΩ/cm的去离子水。

2.2 样品制备方法与步骤

采用再沉淀法制备包覆DPBF的单线态氧纳米探针，首先配置DPBF(500×10-6g/mL)、PS(2000×10-6g/mL)和DTS(2000×10-6g/mL)的THF溶液；待溶液充分溶解后，分别配置DPBF、PS和DTS质量比为10∶40∶50、15∶35∶50、20∶30∶50和25∶25∶50的混合溶液，并通过添加THF使其最终浓度为400×10-6g/mL；然后取0.5 mL混合溶液在超声振荡条件下迅速注入到8 mL的去离子水溶液中，并且调节溶液的pH值为9；最后将悬浮液静置2 h，并于去离子水中透析24 h以除去有机溶剂四氢呋喃，即得到包覆DPBF的纳米颗粒。

2.3 纳米颗粒表征方法

实验过程中纳米颗粒的吸收光谱由日本分光株式会社生产的型号为V-550 的紫外分光光度计测得；样品的透射电子显微镜成像由日立公司生产型号为JEM 1400EX的透射电子显微镜测得；利用马尔文公司生产的型号为Nano ZS90的激光粒度仪对纳米颗粒的动态光散射粒径进行表征。

3 结果及讨论

3.1 单线态氧纳米探针的制备与表征

基于再沉淀法制备二氧化硅包覆DPBF的单线态氧纳米探针。在超声条件下把聚苯乙烯、硅氧烷和DPBF的混合溶液注入到pH=9的溶液中；注入后疏水的聚苯乙烯和硅氧烷为避免与水接触，向内折叠成球形纳米颗粒，DPBF随机地分散于纳米颗粒中；硅氧烷基团在碱性环境下迅速发生水解和缩聚,在纳米颗粒表面形成二氧化硅壳层，可以有效地将DPBF与水隔离，进而起到保护作用。纳米探针的形貌通过透射电子显微镜进行表征，如图1(a)所示，纳米颗粒分布较为均匀，分散性良好，呈球形，表面光滑，粒径约为200 nm。图1(b)是马尔文粒度仪测得的动态光散射粒径，纳米颗粒的粒径主要分布在200 nm左右，与透射电镜测得的粒径结果一致。放置48 h以后，纳米颗粒的动态光散射粒径略微增加，约为230 nm左右(图1(c))，证明其具有较好的稳定性。图2为DPBF分别溶于DMSO溶液中和封装于纳米颗粒内的吸收光谱。溶解于DMSO中的DPBF吸收峰位于410 nm左右，而纳米颗粒中的DPBF吸收峰则位于426 nm，吸收峰红移是由于DPBF的局域环境发生改变引起的。

图1 (a)单线态氧纳米探针的TEM图像;(b)单线态氧纳米探针的动态光散射粒径分布;(c)放置48 h后，纳米探针的粒径分布。Fig.1 (a)TEM images of singlet oxygen nanoprobes.(b)Histogram of hydrodynamic diameter data measured by dynamic light scattering.(c)Hydrodynamic diameter recorded after 48 h.

图2 DPBF溶于DMSO溶液中和封装于纳米颗粒内的吸收光谱Fig.2 Absorption spectra of DPBF dissolved in DMSO aqueous solutions and encapsulated in nanoparticles

3.2 单线态氧敏感性检测

为了选择最佳的DPBF掺杂浓度以制备高灵敏度的单线态氧纳米探针，我们分析了封装不同比例DPBF(10%、15%、20%、25%)的DPBF-NPs的吸收光谱随激光辐照的变化情况(图3)。随着DPBF浓度的增大，DPBF-NPs位于426 nm的吸收峰逐渐增强。为测试其单线态氧敏感性，取2 mL DPBF-NPs分散溶液与20 μL的0.1 mg/mL的ICG溶液混合，然后利用808 nm激光器进行激光辐照，即获得DPBF吸收强度随辐照时间变化的曲线。如图4(a)所示，随着激光辐照时间的增加，DPBF和ICG的吸收峰逐渐降低。辐照12 min以后，DPBF的吸收峰几乎完全猝灭。表明ICG被光激发后产生单线态氧，并与纳米颗粒中的DPBF反应，致使其吸收逐渐降低[20-23]。为了描述不同掺杂浓度的纳米探针对单线态氧的敏感性，我们分析375～475 nm之间的吸收峰面积变化来定量表征DPBF的猝灭效果。如图4(b)所示，10%-DPBF-NPs中DPBF含量相对较少，辐照后猝灭率约为70%；15%-DPBF-NPs在激光照射12 min之后，猝灭率达到86%。表明更多比例的DPBF与1O2发生了反应，15%-DPBF-NPs对单线态氧具有良好的敏感性。而对于20%-DPBF-NPs，由于其DPBF掺杂浓度相对较高，猝灭率低于15%-DPBF-NPs。

为了研究在不同辐照功率下DPBF-NPs对单线态氧的敏感性，我们进一步选择50 mW和210 mW的激光进行辐照，然后表征其吸收光谱变化。如图5(a)所示，50 mW激光辐照12 min后，DPBF吸收强度猝灭率约为40%；采用210 mW激光辐照后，可能由于功率过高，破坏了光敏剂的荧光基团，致使ICG产生单线态氧的效率变低，12 min后猝灭效率比15%-DPBF-NPs略低，约为75%。实验结果表明选择合适的激光功率可以优化DPBF-NPs对单线态氧的检测效果。为了分析单线态氧纳米探针的光稳定性，我们使用130 mW的激光辐照15%-DPBF-NPs。如图5(b)所示，DPBF的吸收峰变化微弱，激光辐照12 min后仅下降约2%，证明DPBF具有比较强的光稳定性。由于ICG存在光热现象，在持续的激光辐照下，纳米探针的环境温度会发生变化。因此，我们分析了纳米探针在不同温度下的吸收光谱，可以看出当温度由20 ℃升高到40 ℃时，DPBF的峰值下降约10%，对比单线态氧的猝灭效果，温度对纳米探针的影响较弱。

图3 掺杂不同浓度DPBF的纳米颗粒的吸收光谱Fig.3 Absorption spectra of nanoparticles doped with different concentrations of DPBF

图4 (a)15%-DPBF-NPs在130 mW激光辐照下的吸收光谱，每辐照3 min后进行吸收光谱表征；(b)不同DPBF掺杂浓度的纳米探针的吸收峰猝灭。Fig.4 (a)Absorption spectra of 15%-DPBF-NPs under laser irradiation.After 3 min of irradiation,the absorption spectra is tested.(b)Absorption peak quenching of nanoprobes doped with different DPBF concentrations after laser irradiation.

图5 (a)在不同功率的激光辐照下,单线态氧敏感性的柱状图；(b)15%-DPBF-NPs在130 mW激光辐照下的吸收光谱；(c)在不同温度下，15%-DPBF-NPs吸收峰的变化趋势图。Fig.5 (a)Histogram of singlet oxygen sensitivity of nanoprobes under laser irradiations with different power.(b)Absorption spectra of 15%-DPBF-NPs irradiated by 130 mW laser.(c)Trends of absorption peak of 15%-DPBF-NPs at different temperatures.

为分析单线态氧纳米探针的检测灵敏度，我们分别使用溶于DMSO中的DPBF溶液和封装DPBF的荧光纳米探针对ICG的光动力现象进行检测。首先取20 μL的0.5 mg/mL DPBF溶液与微量ICG混合，待混合均匀后进行激光辐照，然后表征吸收光谱。如图6所示，随着辐照时间的增加，溶于DMSO中的DPBF猝灭率仅约为10%。这是因为DPBF溶解于有机溶剂，在水中的溶解性差，单线态氧不易与DPBF接触发生反应，从而导致水溶液中1O2的检测灵敏度较低[24]。因此在光动力治疗过程中，将单线态氧检测剂封装于纳米颗粒中制成水溶性较好的纳米探针，能够优化单线态氧的检测效果。

图6 溶解于DMSO中的DPBF与DPBF-NPs对单线态氧的敏感性对比Fig.6 Comparison of the sensitivity of DPBF in DMSO and DPBF-NPs to singlet oxygen

4 结论

本文从光动力治疗出发，通过简单易制的方法制备了一种新型的单线态氧纳米探针。该探针具有核壳型结构，在二氧化硅包覆的核心部分掺杂DPBF分子，有效提高了探针分子的水溶性，进而提高了纳米探针的单线态氧灵敏度。通过分析不同DPBF掺杂浓度和激光辐照功率，发现在130 mW激光辐照下，15%-DPBF-NPs的吸收峰有明显的下降，猝灭率能够达到86%。该单线态氧纳米探针具有较小粒径、良好水溶性和高的灵敏度，在光动力治疗领域具有很广阔的应用前景。