山东银莲花叶片形态结构对异质生境和海拔变化的响应

于文英,高 燕,逄玉娟,王 鸷,卞福花,*

1 烟台大学光电信息科学技术学院, 烟台 264005 2 烟台市昆嵛山林场, 烟台 264112 3 烟台大学生命科学学院, 烟台 264005

全球变暖和日益增加的水资源短缺是农林业可持续发展面临的两个重大问题,植物如何适应复杂多变的自然环境一直是植物学家们致力研究的核心与重点[1]。生物适应环境同时影响环境,二者相互影响、相互依赖、相辅相成,在漫长的进化过程中,逐步形成了各种有效适应环境的机制。研究植物对环境的适应策略对其保护、栽培和引种等都具有重要的实际应用价值。

山东银莲花(Anemoneshikokiana(Makino) Makino)是胶东半岛和日本四国岛特有、狭域、间断分布的极小种群。在中国间断分布于山东昆嵛山和崂山,包含两个典型的异质环境：如昆嵛山海拔650—800 m湿润、阴暗的针阔混交次生林和海拔800 m以上干旱、强光照的山顶灌丛[2]。异质的生境中细胞学水平、DNA水平和蛋白质水平具有较高的多样性[3- 5],表明该物种对两种差异明显的生境表现出极强的适应性。山东银莲花仅有地下根状茎,无地上茎,只有基生叶,叶片是植物进行光合作用以及与外界环境进行物质、能量交换的主要器官,因此叶片是该种响应异质生境的最佳部位,研究叶片的外部形态及其内部解剖结构的变化对揭示其适应策略具有重要意义,为将来研究其适应机制提供基础。

本研究通过对不同海拔、不同生境中山东银莲花叶片外部形态和内部结构特征的研究,揭示该种植物对不同海拔和异质生境的响应机制,为将来分子水平上揭示其适应机制打下基础,以达到更好的保护和利用之目的。

1 取样地点与策略

昆嵛山位于山东省东部的胶东半岛,属于暖温带季风气候,兼有海洋性气候,四季分明,季风显著,雨量充沛,空气湿润,光照充足。年平均气温11—12℃,年降雨量800—1000 mm,主要集中在6—9月,全年无霜期200 d左右,最高海拔为923 m,植被类型为暖温带落叶阔叶林。

山东银莲花在昆嵛山多见于680 m以上针阔混交林下和山顶灌丛,自700 m开始,海拔梯度每垂直升高50 m设置一条样带,共5个样带：700、760、800、850、900 m,前3个代表林下生境,后两个代表山顶生境。每条样带内平行随机选取多年生植株3—5棵,每棵采集一片相同位置、成熟、没有明显病菌症状或者动物咬噬的叶片,编号、装入自封袋,当天带回实验室,冰箱冷藏保存备用。同时选择每棵植株上另一片相同位置的叶片,自中部剪取2—3个1 cm×1 cm小块,直接放入FAA固定液中固定保存,用于石蜡包埋切片和叶片上、下表皮及气孔观察。

2 研究方法

2.1 山东银莲花叶片形态学研究

2.1.1 叶片表面附属结构的差异

用leica体视显微镜系统观察不同生境内不同海拔山东银莲花叶片背、腹两面的附属结构,自叶缘至叶片中部随机选择3个区域,每个区域观察3个视野,拍照并用系统自带软件统计其长短、大小、密度等。

2.1.2 叶片形态的差异

扫描仪扫描叶片,同时加标尺作为叶片长宽参照,保存图像。利用ImageJ图像处理软件测定叶片的长、宽和面积。最后将叶片放入65℃烘箱直至恒重,用万分位的电子天平称其干重,计算比叶面积,比叶面积=叶面积/叶干重。

2.2 山东银莲花叶片解剖结构的研究

2.2.1 气孔及表皮细胞的差异

取FAA中固定的叶片小块,用清水冲洗后,放入10%的次氯酸钠溶液中浸泡至叶片发白,取出并用蒸馏水清洗,采用离析刮制法制取叶片上、下表皮,进行酒精梯度脱水、二甲苯透明、染色,制成临时装片,显微镜观察、拍照。

随机选择3个视野,分别统计上、下表皮气孔数量和表皮细胞数量,用显微系统自带软件计算上、下表皮的气孔密度(个/mm2)、表皮细胞密度(个/mm2)；计算气孔指数,气孔指数=100×气孔密度/(气孔密度+表皮细胞密度)；每个视野随机选择3个气孔放大拍照,显微镜自带测量系统,同时目镜测微尺辅助测其长、宽,计算相对开度,气孔相对开度=气孔宽/气孔长。

2.2.2 叶肉组织的差异

常规石蜡包埋组织切片,显微镜观察,随机选择3个视野拍照。显微镜自带测量系统,同时目镜测微尺辅助测量叶片厚度、上下表皮厚度、栅栏组织和海绵组织厚度,每项每个视野测量三次。

2.3 数据统计分析方法

所有数据用Excel记录整理,并计算平均数及标准差,SPSS 17.0软件进行统计分析和差异显著性检验(P<0.05)。

3 结果与分析

3.1 叶片表面附属结构

利用体视镜观察发现,山东银莲花叶片背面的表皮毛分布均匀,纤细、不分枝；叶片腹面的表皮毛短、硬,分布不均匀,主要密集于叶脉,尤其是较大的叶脉内侧,朝向于一个方向,非叶脉处毛稀疏、细且短。

图1是5个海拔梯度样带内山东银莲花背、腹两面表皮毛长短和密度的比较。由图可知,叶片背面毛的长度长于叶片的腹面,与海拔差异无关。腹面毛长度随海拔升高而略微缩短,700 m处表皮毛明显最长；背面毛的长度与海拔没有明显的关系。腹面表皮毛密度850 m以上表现出增加的趋势；背面表皮毛密度在800 m以下逐渐增加,850 m下降并趋于平稳。

700—800 m林下和850—900 m山顶两种不同生境中,叶片背面毛的长度总是长于叶片的腹面,林下(700、760、800 m)叶片腹面表皮毛比山顶(850、900 m)腹面表皮毛长；林下叶片表皮毛的密度背、腹两面都略大于山顶的密度,表明生境对表皮毛的影响大于海拔对它的影响。

图1 不同海拔山东银莲花叶片表皮毛长度和密度的比较Fig.1 Comparison of length and density of epidermal hairs in leaf blade of A. shikokiana from different elevation gradients

3.2 叶干重和比叶面积

从图2可以看出,叶长、宽、面积对不同生境和海拔变化不敏感,未表现出明显的差异,山顶(850、900 m)叶面积与林下(700、760、800 m)叶面积大小差异不大,叶干重760 m以上随海拔升高而增加,山顶叶干重明显高于林下,比叶面积山顶明显低于林下,并且差异性显著(P<0.05)。

图2 不同海拔山东银莲花叶片形态比较Fig.2 Comparison of leaf morphology of A. shikokiana from different elevation gradients

3.3 表皮气孔

显微观察发现,上、下表皮细胞形状不规则、排列紧密、彼此嵌合。5个海拔梯度内的叶片上表皮均没有气孔,下表皮具有无规则型的气孔,同一生境不同海拔的叶片气孔排列差别不明显,山顶较林下气孔排列紧密整齐(图3)。

图3 山东银莲花叶表皮比较Fig.3 Comparison of leaf epidermisesa. 混交林上表皮; b. 混交林下表皮; c. 灌从上表皮; d. 灌从上表皮

图4是5个海拔梯度样带内山东银莲花气孔密度、气孔相对开度和气孔指数的比较。气孔相对开度与海拔负相关,随海拔升高而减小,差异性显著(P<0.05)；而气孔密度和气孔指数与海拔没有明显的相关性,差异性不显著(P>0.05)。山顶与林下相比较,气孔密度和气孔指数有升高的趋势,表明山东银莲花气孔对生境比对海拔的变化更敏感。

图4 不同海拔山东银莲花叶片气孔的比较Fig.4 Comparison of leaf stomata of A. shikokiana from different elevation gradients

3.4 叶片厚度

林下栅栏组织细胞排列不整齐、疏松,山顶栅栏组织仍是一层细胞,但是排列更加紧密、整齐,较林下更厚,海绵组织山顶较林下更加发达(图5),同一生境内不同海拔梯度的叶肉细胞差异不明显。

图6是5种海拔梯度样带内山东银莲花叶片厚度、上下表皮厚度、栅栏组织和海绵组织厚度的比较。海拔变化对各单因素参数引起的差异不显著(P>0.05),山顶与林下比较,叶片厚度、栅栏组织厚度和海绵组织厚度均增加,差异显著；上下表皮厚度没有明显差异(P>0.05),表明表皮细胞对海拔变化和生境变化不敏感。山顶叶片加厚的主要因素在于叶肉组织的改变,尤其是海绵组织厚度的增加从而增加了叶片的厚度。

图6 不同海拔山东银莲花叶片厚度的比较Fig.6 Comparison of the leaf thickness in A. shikokiana from different elevation gradients

4 讨论

4.1 山东银莲花对异质生境的响应

植物适应环境的选择压力是非常复杂的过程,为了适应环境,必须调整自身的相应机制,启动相关的信号系统满足需要。叶片是植物暴露在空气中进行同化作用的主要器官,其组织结构对周围环境反应敏锐,其形态结构在外界生态因素的长期作用下具有很大的变异性和可塑性,与植物生长对策及利用资源的能力紧密相关[6]。针阔混交林下水分充足、营养丰富,但是缺少光照,山顶灌丛光照充足,但是水分亏缺。山东银莲花为了适应两种不同的生活环境,叶片形态和内部解剖结构表现出明显的差异,以获取最大利益满足自身需求。

(1)比叶面积 比叶面积与植物相对生长速率、光合速率、叶氮含量有关,可用来反映植物的碳获取策略,是生理过程权衡的最佳指标[7]。比叶面积较大的植物叶片资源捕获面积大,具有较高的净光合速率,一般光照越弱、叶片越薄、单位面积的干重越小,比叶面积则越大。本研究混交林下的山东银莲花接受较弱的光照,具有明显大于山顶的比叶面积,符合植物叶片适应弱光照的一般规律。比叶面积较低的植物将更多的物质用于构建保卫构造或者增加叶肉细胞密度,可以有效的减小蒸腾和防止叶片过度失水[8],更好的适应资源贫瘠和干旱的环境。山顶山东银莲花具有较低的比叶面积,一定程度上可以保持叶片水分,增强抗旱能力。

(2)叶片厚度 山顶的山东银莲花叶片增厚,尤其是栅栏组织的增厚能够减少水分的散失；林下山东银莲花具有较薄的叶片以缩短光线到达叶绿体的距离,使其最大量地吸收微弱的光线满足光合作用之所需。干旱条件下黄瓜叶片因栅栏组织和海绵组织厚度的减小使其总厚度减小[9],与本研究结果不一致。叶片厚度与资源获取、水分保存和同化有关,较厚的栅栏组织增加叶片内部水分向叶片表面扩散的距离和对水流的阻力,减小水的蒸腾,提高水的利用效率,更好的适应干旱胁迫[10-11],这是对本研究山顶叶片厚度增加最好的解释。

(3)气孔 气孔是植物适应水分、光照的主要限制因子之一,是植物气体交换的微型阀门,控制着空气和水分的进出,旱生植物的气孔有助于植物在缺水时保持较高的光合速率[12- 14],表现在气孔大小、密度、开度等方面。山顶植株气孔密度增加,但是减小了气孔大小甚至关闭从而减少过度蒸腾,与LIU等的研究结果一致[9]。林下的山东银莲花为了更加顺畅的进行气体交换,满足光合作用需要,并排出多余的水分,具有较大的气孔相对开度以适应林下的环境。

虽然山东银莲花叶片的多数特征表现出与生境的高度适应,但是,某些特征却表现出与环境条件不匹配的“非适应性”。

(1)表皮毛 林下植株为充分接受微弱的光照一般具有较短的表皮毛和较低的密度,山顶为减少蒸腾多具有较长的表皮毛和较高的表皮毛密度,而实验结果却相反。可能的原因是叶片背光面表皮毛对光照的影响不大,主要作用可能只是避免害虫咬噬起保护作用；上表皮虽然接受阳光照射,但是表皮毛主要密集于叶脉内侧,而且短、硬、沿叶脉方向倾倒,不影响叶肉细胞接受光照。

(2)气孔密度 山顶为保持水分多具有较低的气孔密度,而本研究山顶气孔密度较大,但是气孔相对开度较低、光照较强的时间段多数关闭以减少水分的散失。有研究表明气孔孔径大小随气压和温度的升高而下降[15],本研究气孔开度是否也受气压和温度影响,有待进一步研究。而且植物叶片气孔密度越大,有利于短时间内充分利用有效水分进行光合作用[16]。多数植物在中度干旱胁迫下,气孔密度增加,而在重度干旱胁迫下,气孔密度减少[17-18],因此可能山顶只是处于中度干旱胁迫。Zhao等认为水分亏缺刺激了气孔生成,导致气孔密度增加[19]。但Sam等认为干旱胁迫下植物较高的气孔密度与叶面积减小有关[20]。此外,杨惠敏和王根轩的研究结果发现干旱条件下,植物气孔减小,密度增大,分布趋向均匀,在保持光合的同时减小水分的散失[21],与本实验结果一致。由此看出,各种植物适应环境的特征和机制有共性也有其各自的特性,结果不具有普适性。

4.2 山东银莲花对海拔变化的响应

海拔梯度包含了温度、湿度、光照和土壤等诸多环境因子的剧烈变化,气温、气压、CO2浓度等环境因子随海拔升高而降低,而光照强度则随海拔升高而增加[22]。近年来,通过海拔梯度上植物叶片性状与环境因子相互关系来研究环境变化,已成为研究全球气候变化的热点之一[23-24]。

本研究只有叶片腹面表皮毛的长度和气孔相对开度与海拔梯度表现出负相关性,随海拔升高而逐渐减小,更好地满足其生活需要。其余叶片特征如栅栏组织和海绵组织厚度、气孔密度、比叶面积等对海拔变化均未表现出明显的规律性,即对海拔变化不敏感。可能的原因在于本研究由于两个生境海拔相差不大,每个生境再分成不同的海拔梯度,可能对结果无明显影响。

某些单一叶片特征与海拔不具有明显的相关性,但是将两个或多个特征因素综合考虑,可以看出它们存在协同关系。如比叶面积与气孔密度,二者对海拔变化均未表现出规律性变化,但是二者之间具有彼此消长的关系,以此适应不同环境。Romero-Munar等也发现叶片可塑性和气孔调节相互协调、相互配合共同决定植物适应水分胁迫的能力[25]。植物气孔特征与叶片形态特征对环境变化的适应存在一定的协同变异性,但这种关系不具有普适性,主要与气孔特征和叶片功能性状的选择压力存在差异以及物种分布相关[26]。

5 总结

生境复杂多变,生活在其中的植物改变生理、形态与结构做出响应,通过多种性状的组合来适应变化的环境。植物对环境的响应是一个复杂的、综合的过程,是各个功能性状相互协调、相互配合的过程。不同种植物或同一种植物叶片对环境中的生态因子敏感程度有所不同,对环境变化的适应具有多样性。

林下的山东银莲花具有更高的光合能力,山顶的具有更好的水分利用效率和保水能力,都能有效协调碳同化和水分利用,表现出良好的适应能力。

山东银莲花分布狭域、稀有、种群小,具有重要价值,存在两种对比鲜明的异质生境,是理想的研究生态适应策略和适应机制的非模式植物材料。对它的研究既能为今后的保护和利用服务,同时为将来研究山东银莲花适应性的分子机制打下基础,为其他植物的研究提供理论参考。